RNA干擾技術(shù)（RNAi）是通過小的RNA分子（miRNA、siRNA、shRNA）實現(xiàn)抑制靶基因的表達。因其易操作性，RNAi在某些領(lǐng)域逐步取代同源打靶技術(shù)，成為研究基因功能的重要工具。miRNA及siRNA主要用于瞬時抑制目標(biāo)基因的表達，檢測基因功能。shRNA與hU6啟動子、U6終止子相結(jié)合構(gòu)成shRNA表達元件，主要用于構(gòu)建具有穩(wěn)定抑制作用的工程細(xì)胞系。目前應(yīng)用比較成熟的shRNA表達元件的遞呈系統(tǒng)主要有質(zhì)粒載體和病毒（腺病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘病毒等）載體。質(zhì)粒載體整合效率極低，且靶位隨機；病毒載體雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但其插入位點隨機，給基因的后續(xù)定位帶來困難并存在潛在的危害，因此，病毒載體不適于轉(zhuǎn)基因動物的商品化應(yīng)用。打靶載體因其特異性位點插入功能從而成為轉(zhuǎn)基因動物目的基因遞呈系統(tǒng)的研究熱點。由于RNAi技術(shù)的不斷成熟、基因功能研究的不斷突破，為轉(zhuǎn)基因動物研究過程中對病原或宿主基因進行合理干擾抑制成為可能。本文將打靶載體與RNAi技術(shù)相結(jié)合，為轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。本實驗通過對豬的基因組進行分析，針對豬β3基因中的內(nèi)含子區(qū)域設(shè)計兩對擴增引物，分別用于擴增同源重組所需要... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

病毒基因組結(jié)構(gòu)、裂解位點及病毒粒子構(gòu)像

圖 1.2 簡單同源重組機制Figure 1.2 Simple Gene Replacement源打靶技術(shù)實施的工具，打靶載體的最基本組件包括同源重組臂重組效率較低，在實際應(yīng)用過程中往往引入正負(fù)篩選標(biāo)記基因，廣泛使用的正篩選標(biāo)記基因包括：嘌呤霉素-N-乙�；D(zhuǎn)移酶基因因（NEO），潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hph），殺稻瘟菌素脫氨酶基核糖轉(zhuǎn)移基因（gpt）。經(jīng)常使用的負(fù)篩選標(biāo)記有兩種，即：單純皰毒素A片段（DTA）（Alexandra L. Joyner, 2000）。記往往有兩個目的：1. 篩選整合有外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞；2. 在正插入新的編碼基因或者是缺失已經(jīng)存在的基因序列）。引入負(fù)篩選獲得載體基因的工程細(xì)胞誘導(dǎo)死亡。由于載體的線性化對于打靶合載體具有決定性的影響，因此在設(shè)計替換載體時，需要設(shè)計一切位點用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前的線性化。同源臂外的非替換區(qū)域上在同源含子區(qū)域，或者是替換內(nèi)含子區(qū)域的部分區(qū)段并不一定會破壞基因此，針對不同的目的，所選擇的突變或者是整合區(qū)域會有所不以及序列與基因組序列的一致性對于同源打靶的效率有著較大的的最適長度為 5~10 kb。盡管選擇更長的同源臂可以提高同源重組

圖 1.3 Cre/loxP 與 Flp/FRT 特異刪除位點序列特征Figure 3 sequence fearue of Cre/loxP and Flp/FRT deleting system1.6 核酸進入細(xì)胞核的遞呈系統(tǒng)1.6.1 核顯微注射技術(shù)核顯微注射技術(shù)就是通過極細(xì)的針頭將核酸直接注入目的細(xì)胞的細(xì)胞核中，低（<1%），代價昂貴。為了得到幾個成功的轉(zhuǎn)基因胚胎，往往需要對成千上萬的微注射。同時隨機插入導(dǎo)致的多樣化表達，也是制約該技術(shù)使用的一個因素。雖約，核顯微注射技術(shù)仍然在轉(zhuǎn)基因牛、羊以及豬的培育中得到成功應(yīng)用（J. M. R1.6.2 病毒載體遞呈技術(shù)1974 年，Jaenisch 和Mintz首先使用SV40 病毒載體將外源DNA攜帶入囊胚中莫洛尼白血病病毒可以在胚胎著床前將病毒DNA插入動物基因組（R. Jaenisch, et進了反轉(zhuǎn)錄病毒載體在外源DNA插入機體基因組的使用。一些病毒載體具有較大使得載體的承載能力較強，如：慢病毒可以承載至少三個額外的基因。一個典型括獨立的載體以及組裝載體，其中獨立的病毒載體用于攜帶目的基因，組裝質(zhì)粒

【參考文獻】：
期刊論文
[1]沙門菌載體重組疫苗的研究進展[J]. 馬延濱,高閃電,叢國正,�；菔|.  中國獸醫(yī)雜志. 2011(06)
[2]雙篩選標(biāo)記打靶載體的構(gòu)建及其功能鑒定[J]. 李軍華,韓翠芹,鄧捷,王華巖.  生物工程學(xué)報. 2010(12)



本文編號：3318972