兔病毒性出血癥（Rabbit Hemorrhagic Disease, RHD）,俗稱“兔瘟”,在中國的江蘇地區(qū)首次爆發(fā),兔出血癥病毒（Rabbit Hemorrhagic Disease Virus, RHDV）屬于兔病毒屬中的嵌杯狀病毒科（Calicivirus）,（?）夠引起兔的急性、高度接觸性、敗血性傳染病,通常給養(yǎng)兔業(yè)帶來毀滅性的傷害。肝臟是RHDV侵染的主要器官,與RHDV相互作用蛋白的研究是重點研究領域之一。本實驗室前期通過SMART技術(shù)篩選和鑒定了與VP60相互作用的相關(guān)候選蛋白。鐵蛋白重鏈（Ferritin Heavy Chain, FTH）是與VP60相互作用的候選蛋白之一,并利用GST pull down. ELISA. Co-IP及血凝試驗等方法驗證了FTH與RHDV具有相互作用。本研究對鐵蛋白重鏈截短,進行體外表達,鑒定鐵蛋白重鏈與RHDV相互作用的位點,為抗病毒藥物的研制提供幫助。為精確定位兔鐵蛋白重鏈與RHDV相互作用的位點,本研究提取兔肝臟組織總RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴增FTH基因并分節(jié)段克隆于pGEX-6P-1載體中,重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學黑龍江省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 兔病毒性出血癥概況
    1.2 病原學
    1.3 臨床癥狀及病理變化
        1.3.1 臨床癥狀
        1.3.2 病理變化
    1.4 流行病學特點
    1.5 病毒生活周期
    1.6 診斷方法
        1.6.1 電鏡法
        1.6.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)
        1.6.3 凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗
        1.6.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
        1.6.5 環(huán)介導恒溫快速擴增(LAMP)
        1.6.6 實時熒光定量PCR(real-time PCR)
    1.7 防控和疫苗
    1.8 研究蛋白質(zhì)相互作用的方法
        1.8.1 酵母雙雜交
        1.8.2 免疫共沉淀
        1.8.3 GST-pull down
        1.8.4 表達克隆系統(tǒng)技術(shù)
        1.8.5 病毒鋪覆蛋白試驗(VOPBA)
    1.9 鐵蛋白研究進展
    1.10 本研究的目的和意義
第二章 兔鐵蛋白重鏈截短基因的克隆及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 實驗動物與病毒
        2.1.2 菌株及載體
        2.1.3 酶及主要試劑
    2.2 方法
        2.2.1 基因擴增的策略
        2.2.2 擴增引物的設計
        2.2.3 細胞總RNA的提取
        2.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.5 克隆質(zhì)粒的提取與測序鑒定
        2.2.6 表達載體的構(gòu)建
        2.2.7 重組蛋白的表達
        2.2.8 重組蛋白的純化
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 序列分析及表達載體的鑒定
        2.3.2 FTH截短重組蛋白表達純化
    2.4 討論
第三章 兔鐵蛋白重鏈與RHDV相互作用位點的鑒定
    3.1 材料和方法
        3.1.1 質(zhì)粒、毒株及菌株
        3.1.2 主要化學試劑
        3.1.3 主要設備
        3.1.4 誘餌載體pGBKT7-X的構(gòu)建及鑒定
        3.1.5 捕獲載體pGBKT7-Y的構(gòu)建及鑒定
        3.1.6 捕獲載體pGADT7-Y的自激活檢測和毒性檢測
        3.1.7 pGBKT7-X與pGADT7-Y共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109
        3.1.8 ELISA驗證FTH截短重組蛋白與RHDV具有相互作用
        3.1.9 FTH截短重組蛋白中和RHDV的血凝試驗
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 RHDV病毒蛋白基因的擴增
        3.2.2 誘餌載體pGBKT7-X的構(gòu)建及鑒定
        3.2.3 誘餌載體pGBKT7-X的毒性檢測分析
        3.2.4 誘餌載體pGBKT7-X的自激活檢測分析
        3.2.5 捕獲載體pGADT7-Y的構(gòu)建及鑒定
        3.2.6 捕獲載體pGADT7-Y的自激活和毒性檢測
        3.2.7 酵母雙雜交驗證結(jié)果
        3.2.8 ELISA驗證結(jié)果
        3.2.9 血凝活性實驗驗證結(jié)果
    3.3 討論
第四章 全文結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]ELISA驗證兔鐵蛋白重鏈與RHDV VP60相互作用[J]. 孫宏勇,劉家森,王澤祥,陳淑慧,單麗玲,郭冬春,姜騫,林歡,曲連東.  中國預防獸醫(yī)學報. 2013(09)
[2]兔出血癥病毒衣殼蛋白與次級結(jié)構(gòu)蛋白的相互作用[J]. 楊宗偉,倪征,云濤,陳宗艷,李傳峰,劉光清.  科學通報. 2012(24)
[3]表達克隆技術(shù)在蛋白質(zhì)相互作用研究中的應用[J]. 柳迪,唐麗,賀福初.  細胞與分子免疫學雜志. 2012(08)
[4]兔出血癥病毒衣殼蛋白VP60與兔肝臟細胞中相互作用蛋白的初步篩選[J]. 穆亞芳,劉家森,郭東春,李茂中,原冬偉,姜騫,林歡,曲連東.  中國預防獸醫(yī)學報. 2011(05)
[5]兔病毒性出血癥研究進展[J]. 湯少偉.  上海畜牧獸醫(yī)通訊. 2010(05)
[6]酵母雙雜交技術(shù)研究與應用進展[J]. 李先昆,聶智毅,曾日中.  安徽農(nóng)業(yè)科學. 2009(07)
[7]TaqMan MGB探針實時檢測兔病毒性出血癥病毒[J]. 張秀娥,田夫林,李希友,李建亮,崔言順.  中國獸醫(yī)學報. 2007(06)
[8]遺傳性酪氨酸血癥Ⅰ型10例的臨床診斷分析[J]. 李曉瑜,杜敏聯(lián),莊思齊,莫恩明,馬華梅,李燕虹,陳紅珊,丘小汕.  中華兒科雜志. 2006(06)
[9]與接頭蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鑒定[J]. 程小星,蹇銳.  細胞與分子免疫學雜志. 2005(04)
[10]人肝癌組織中p53與HSP70相互作用的初步研究[J]. 崔崇偉,楊守京,劉雁平,劉彥仿.  細胞與分子免疫學雜志. 2003(02)

碩士論文
[1]兔鐵蛋白重鏈與兔出血癥病毒相互作用的研究[D]. 孫宏勇.中國農(nóng)業(yè)科學院 2013
[2]人工感染兔出血癥病毒兔肝臟的蛋白質(zhì)組學分析[D]. 李茂中.中國農(nóng)業(yè)科學院 2012
[3]兔出血癥病毒VP60蛋白與膜突蛋白相互作用的鑒定[D]. 穆亞芳.中國農(nóng)業(yè)科學院 2011



本文編號：3318841