發(fā)布時間：2021-07-25 23:44

　　乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的一種危害嚴重的蟲媒性人畜共患病。JEV主要是通過豬和蚊子進行傳播,感染后主要引起母豬流產、死胎以及公豬的睪丸炎,不僅對養(yǎng)豬業(yè)造成很大的損失,同時也嚴重威脅人類的健康。本研究用原核表達的NS5蛋白和純化的JEV分別免疫小鼠,經(jīng)過細胞融合篩選到了6株特異性的JEVNS5蛋白單抗和5株E蛋白單抗,并對這些單抗的生物學特性進行了驗證,具體研究內容如下：1. JEV NS5蛋白單克隆抗體的制備及其靶抗原表位的研究利用原核表達的JEV NS5蛋白免疫小鼠,通過細胞融合篩選到了6株特異性的單克隆抗體,分別為：1G6.1F12、2A5、3C4、3H7、3F10,亞型分別為IgG2b、 IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG2a和IgG2a,輕鏈均為Kappa鏈。經(jīng)間接免疫熒光（IFA）和Western blot檢測,這6株單抗均具有較好的特異性。在此基礎上,構建NS5真核分片段表達質粒pCMV-NS5（1-405）,pCMV-NS5（406-905）并... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 乙型腦炎的流行病學
        1.1.1 流行特征
        1.1.2 易感群體
        1.1.3 傳播媒介與宿主
    1.2 乙型腦炎病毒的生物學特性
        1.2.1 乙型腦炎病毒的形態(tài)及基因組的結構和功能
        1.2.2 乙型腦炎病毒的入侵和合成過程
        1.2.3 乙型腦炎病毒的毒株間變異
    1.3 乙型腦炎的臨床癥狀和病理變化
        1.3.1 乙型腦炎病毒的致病機理
        1.3.2 乙型腦炎的病理變化
        1.3.3 乙型腦炎的臨床癥狀
    1.4 乙型腦炎診斷技術的研究進展
        1.4.1 病毒的分離和鑒定
        1.4.2 免疫學診斷
    1.5 研究目的與意義
第二章 日本乙型腦炎病毒NS5蛋白單克隆抗體的制備及其特性分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質粒、菌株、細胞系和實驗動物
        2.1.2 主要藥品、試劑和儀器
        2.1.3 使用的培養(yǎng)基和其配制方法
        2.1.4 緩沖液(溶液)和其配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 蛋白的誘導表達
        2.2.2 誘導表達產物的SDS-PAGE分析
        2.2.3 免疫原與檢測抗原的制備
        2.2.4 動物免疫
        2.2.5 間接ELISA檢測方法的建立
        2.2.6 間接ELISA法檢測小鼠的免疫效果
        2.2.7 SP2/0骨髓瘤細胞的準備
        2.2.8 免疫脾細胞的準備
        2.2.9 飼養(yǎng)細胞的準備
        2.2.10 細胞融合
        2.2.11 陽性雜交瘤細胞的篩選
        2.2.12 陽性雜交瘤細胞的亞克隆
        2.2.13 單克隆抗體的大量制備
        2.2.14 單克隆抗體效價的測定
        2.2.15 單克隆抗體的亞型鑒定
        2.2.16 單克隆抗體的IFA分析
        2.2.17 單克隆抗體的Western blot分析
        2.2.18 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
        2.2.19 JEV不同毒株NS5蛋白氨基酸序列的比對
        2.2.20 3C4株單抗靶抗原表位的三維結構分析
        2.2.21 多肽的設計和合成
        2.2.22 3C4株單抗與合成多肽的反應檢測
    2.3 結果與分析
        2.3.1 NS5蛋白的純化鑒定
        2.3.2 免疫小鼠血清效價的測定
        2.3.3 雜交瘤細胞株的篩選
        2.3.4 單克隆抗體效價的測定
        2.3.5 單克隆抗體的亞型鑒定
        2.3.6 單克隆抗體的IFA檢測
        2.3.7 單克隆抗體的Western blot分析
        2.3.8 單克隆抗體靶抗原表位區(qū)域的分析
        2.3.9 3C4株單抗與不同的JEV毒株的反應
        2.3.10 JEV SX09S-1株與SA14-14-2株、P3株NS5蛋白氨基酸序列的比對
        2.3.11 JEV SX09S-1株與SA14-14-2株、P3株NS5蛋白差異氨基酸
        2.3.12 WNV NS5蛋白RdRp區(qū)3D結構圖
        2.3.13 3C4株單抗與多肽的ELISA檢測結果
        2.3.14 432位氨基酸在NS5蛋白三維結構中的位置
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 日本乙型腦炎病毒E蛋白單克隆抗體制備及其特性分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 毒株、細胞系和實驗動物
        3.1.2 主要藥品、試劑和儀器
        3.1.3 使用的培養(yǎng)基和其配制方法
        3.1.4 緩沖液(溶液)和其配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 病毒的擴增
        3.2.2 小鼠免疫
        3.2.3 小鼠免疫效果檢測
        3.2.4 SP2/0骨髓瘤細胞的準備
        3.2.5 免疫脾細胞的準備
        3.2.6 飼養(yǎng)細胞的準備
        3.2.7 細胞融合
        3.2.8 陽性株的篩選和亞克隆
        3.2.9 單克隆抗體的大量制備
        3.2.10 單抗亞型的鑒定
        3.2.11 單抗生物學特性的分析
        3.2.12 單抗中和活性的檢測
    3.3 結果與分析
        3.3.1 免疫小鼠血清效價的測定
        3.3.2 單克隆抗體效價的測定
        3.3.3 單克隆抗體的亞型鑒定
        3.3.4 單克隆抗體的IFA檢測
        3.3.5 單克隆抗體的Western blot分析
        3.3.6 JEV單抗中和活性的檢測
    3.4 討論
    3.5 小結
結論
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]山西豬源基因Ⅰ型乙型腦炎病毒的分離與鑒定[J]. 曹齊樹,錢平,朱巧艷,錢蘇紅,李靜逸,林飛宏,李祥敏,孫艷芳,陳煥春.  中國獸醫(yī)學報. 2011(05)
[2]檢測豬乙型腦炎病毒抗體間接ELISA方法的建立與應用[J]. 沈婷,周斌,陳溥言.  畜牧與獸醫(yī). 2010(04)
[3]乙型腦炎病毒研究進展[J]. 趙榮樂,鄭光宇.  生物學通報. 2007(07)
[4]豬乙型腦炎研究進展[J]. 鄧永,徐高原.  養(yǎng)殖與飼料. 2007(06)
[5]中國2000～2004年流行性乙型腦炎流行病學特征分析[J]. 陳園生,梁曉峰,王曉軍,李藝星,楊俊峰,李軍宏,尹遵棟,胡苑笙,陸偉.  中國計劃免疫. 2006(03)
[6]新型SPA協(xié)同凝集試驗與血凝抑制試驗檢測豬乙型腦炎病毒特異性抗體的比較[J]. 宋大偉,魏建超,鄭其升,周斌,曹瑞兵,陳溥言.  畜牧與獸醫(yī). 2006(06)
[7]1997至2004年貴州省流行性乙型腦炎病例流行病學分析及控制策略[J]. 宋群鋒,陶沁,余春,蔣維佳,周敬祝,王昭孝.  中國媒介生物學及控制雜志. 2006(02)
[8]遼寧省乙腦病毒的分離與鑒定[J]. 王俊文,付士紅,王環(huán)宇,毛曉燕,劉衛(wèi)濱,何英,孫肖紅,蔡增林,吳立平,趙習芳,韓瑞紅,景雅,梁國棟.  中華實驗和臨床病毒學雜志. 2006(01)
[9]黑龍江省部分地區(qū)蟲媒病毒調查[J]. 王環(huán)宇,付士紅,王俊文,何英,蔡增林,韓瑞紅,劉國平,孫肖紅,張強,唐青,梁國棟.  中華實驗和臨床病毒學雜志. 2005(04)
[10]我國蟲媒病毒研究10年回顧[J]. 王環(huán)宇,梁國棟.  中國公共衛(wèi)生. 2003(04)

博士論文
[1]乙型腦炎病毒與樹突狀細胞的互作研究[D]. 李么明.華中農業(yè)大學 2009
[2]乙型腦炎病毒全基因組分子進化及基因重組研究[D]. 潘曉玲.中國疾病預防控制中心 2009

碩士論文
[1]乙型腦炎病毒雙抗體夾心ELISA抗原檢測方法的建立與應用[D]. 梅力.華中農業(yè)大學 2012
[2]日本乙型腦炎實驗室診斷方法的研究和應用[D]. 孫圣福.華中農業(yè)大學 2004



本文編號：3303007