熱帶泰勒蟲病（Tropical theileriasis）是由環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）感染引起的蜱傳性血液原蟲病,患病動(dòng)物通常表現(xiàn)出體表淋巴結(jié)腫大、高熱、貧血、消瘦等臨床癥狀。環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的宿主單核/巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能夠無限增殖,表現(xiàn)出癌細(xì)胞的生長(zhǎng)特性,即轉(zhuǎn)化特性;當(dāng)感染細(xì)胞用抗寄生蟲藥物布帕伐醌（Buparvaquone,BW720c）處理后,宿主細(xì)胞恢復(fù)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡特性。參考環(huán)形泰勒蟲基因組、蛋白組數(shù)據(jù),同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),本研究選取可能參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化的環(huán)形泰勒蟲裂殖體膜蛋白或分泌蛋白,利用酵母雙雜交技術(shù),篩選與其相互作用的宿主細(xì)胞蛋白。對(duì)環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的細(xì)胞系TaNM1細(xì)胞進(jìn)行siRNA干擾及藥物處理后,檢測(cè)信號(hào)通路關(guān)鍵分子基因的表達(dá)及蛋白磷酸化水平,從而了解互作蛋白分子對(duì)宿主細(xì)胞信號(hào)通路的影響,為闡明環(huán)形泰勒蟲調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.成功構(gòu)建環(huán)形泰勒蟲的7個(gè)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因TaSP、SVSP2、EMM、Glu、CP、URP及Cyp1的pET30a原核表達(dá)載體,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后,純化... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

環(huán)形泰勒蟲生活史Fig.1.1LifecycleofTheileriaannulata(Tretinaetal.,2015)

圖 2.1 目的蛋白跨膜區(qū)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig. 2.1 The transmembrane and signal peptide prediction of target proteins2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及目的蛋白的表達(dá)純化以 TaNM1 cDNA 為模板，經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得片段大小分別為：Tasp，約 558 bp；SVSP2，約1167 bp；CP，約 1050 bp ；Glu，約 387 bp；Cyp1，約 624 bp；URP，約 1017 bp；EMM，約1308 bp，與預(yù)期大小一致（圖 2.2）。將測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 BL21(DE3)中，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng) SDS-PAGE 及 western blot 鑒定，7 種重組蛋白都得到表達(dá)（圖 2.3 和圖 2.4），大小分別為：Tasp，約 50 kDa；SVSP2，約 70 kDa；CP，約 45 kDa ；Glu，約 20 kDa；Cyp1，約 28 kDa；URP，約 42 kDa；EMM，約 55 kDa，除 Tasp 及 SVSP2 外，其他 5 個(gè)蛋白大小與預(yù)測(cè)一致。其中 TaSP 明顯偏大，這可能與其富含 Glu-Pro 及 Gln-Pro 結(jié)構(gòu)有關(guān)，導(dǎo)致該蛋白在電泳時(shí)遷移速率變慢（Schnittger et al., 2002）。此外通過切膠回收、丙酮沉淀及的蛋白稀釋方法對(duì)這 7 種目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng) Bardford 法測(cè)定，這 7 種蛋白的濃度均在 0.3 mg/mL 左右。Western blot 結(jié)果顯示：7 個(gè)純化的目的蛋白條帶單一，而且均能與抗 His 標(biāo)簽蛋白的抗體反應(yīng)（圖 2.5），表明純化的蛋白可用于多克隆抗體的制備。

重組目的蛋白的SDS-PAGE分析

【參考文獻(xiàn)】：
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