熱帶泰勒蟲�。═ropical theileriasis）是由環(huán)形泰勒蟲（Theileria annulata）感染引起的蜱傳性血液原蟲病,患病動物通常表現(xiàn)出體表淋巴結腫大、高熱、貧血、消瘦等臨床癥狀。環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的宿主單核/巨噬細胞、樹突狀細胞及B淋巴細胞在體外培養(yǎng)時能夠無限增殖,表現(xiàn)出癌細胞的生長特性,即轉化特性;當感染細胞用抗寄生蟲藥物布帕伐醌（Buparvaquone,BW720c）處理后,宿主細胞恢復正常細胞的生長及凋亡特性。參考環(huán)形泰勒蟲基因組、蛋白組數(shù)據(jù),同時結合相關文獻,本研究選取可能參與細胞轉化的環(huán)形泰勒蟲裂殖體膜蛋白或分泌蛋白,利用酵母雙雜交技術,篩選與其相互作用的宿主細胞蛋白。對環(huán)形泰勒蟲裂殖體感染的細胞系TaNM1細胞進行siRNA干擾及藥物處理后,檢測信號通路關鍵分子基因的表達及蛋白磷酸化水平,從而了解互作蛋白分子對宿主細胞信號通路的影響,為闡明環(huán)形泰勒蟲調(diào)節(jié)宿主細胞轉化的分子機制奠定基礎。主要研究結果如下:1.成功構建環(huán)形泰勒蟲的7個轉化相關基因TaSP、SVSP2、EMM、Glu、CP、URP及Cyp1的pET30a原核表達載體,經(jīng)誘導表達后,純化... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

環(huán)形泰勒蟲生活史Fig.1.1LifecycleofTheileriaannulata(Tretinaetal.,2015)

圖 2.1 目的蛋白跨膜區(qū)及信號肽預測Fig. 2.1 The transmembrane and signal peptide prediction of target proteins2.3.2 重組質粒的構建及目的蛋白的表達純化以 TaNM1 cDNA 為模板，經(jīng) PCR 擴增獲得片段大小分別為：Tasp，約 558 bp；SVSP2，約1167 bp；CP，約 1050 bp ；Glu，約 387 bp；Cyp1，約 624 bp；URP，約 1017 bp；EMM，約1308 bp，與預期大小一致（圖 2.2）。將測序正確的質粒轉化至 BL21(DE3)中，進行誘導表達。經(jīng) SDS-PAGE 及 western blot 鑒定，7 種重組蛋白都得到表達（圖 2.3 和圖 2.4），大小分別為：Tasp，約 50 kDa；SVSP2，約 70 kDa；CP，約 45 kDa ；Glu，約 20 kDa；Cyp1，約 28 kDa；URP，約 42 kDa；EMM，約 55 kDa，除 Tasp 及 SVSP2 外，其他 5 個蛋白大小與預測一致。其中 TaSP 明顯偏大，這可能與其富含 Glu-Pro 及 Gln-Pro 結構有關，導致該蛋白在電泳時遷移速率變慢（Schnittger et al., 2002）。此外通過切膠回收、丙酮沉淀及的蛋白稀釋方法對這 7 種目的蛋白進行純化，經(jīng) Bardford 法測定，這 7 種蛋白的濃度均在 0.3 mg/mL 左右。Western blot 結果顯示：7 個純化的目的蛋白條帶單一，而且均能與抗 His 標簽蛋白的抗體反應（圖 2.5），表明純化的蛋白可用于多克隆抗體的制備。

重組目的蛋白的SDS-PAGE分析

【參考文獻】：
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