發(fā)布時間：2021-07-13 23:27

　　豬流行性腹瀉病毒（PEDV）,冠狀病毒成員。2010年底,我國發(fā)生了大范圍嚴(yán)重的豬流行性腹瀉（PED）疫情,造成了巨大的經(jīng)濟損失。發(fā)病豬可見嘔吐、水樣腹瀉、脫水等臨床癥狀,造成豬生長遲緩,甚至死亡,被PEDV感染的仔豬死亡率較高,對發(fā)病豬進(jìn)行病理檢查可見萎縮性腸炎。PED的臨床癥狀與組織病理學(xué)特征類似于豬傳染性胃腸炎（TGE）,所以這兩種疾病的鑒別診斷主要依靠分子和血清學(xué)檢測。PEDV包含4個結(jié)構(gòu)蛋白和17種非結(jié)構(gòu)蛋白,其中纖突蛋白（S）以三聚體的形式定位在病毒表面,其主要介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合和受體結(jié)合等基本生物功能,并包含多個中和表位,可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體。因此,豬血清中PEDV S蛋白的抗體水平更能代表豬體內(nèi)的中和抗體水平。本研究將純化后的截短PEDV S重組蛋白通過皮下注射免疫雙峰駝,并利用噬菌體展示技術(shù)共篩選出6株氨基酸序列不相同的納米抗體。之后,我們將一株納米抗體進(jìn)行了生物素標(biāo)記,并建立了一種檢測豬血清中PEDV S蛋白抗體的阻斷ELISA方法。主要內(nèi)容與結(jié)果如下:1.將純化后的截短PEDV S重組蛋白通過皮下注射免疫雙峰駝,四次免疫后,雙峰駝血清中的特異性抗體效價達(dá)到了... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
文獻(xiàn)綜述
    第一章 豬流行性腹瀉病毒與納米抗體的研究進(jìn)展
        1.1 豬流行性腹瀉病毒的研究進(jìn)展
            1.1.1 豬流行性腹瀉病毒的概述
            1.1.2 豬流行性腹瀉的流行情況
            1.1.3 豬流行性腹瀉病毒的分子病原學(xué)
        1.2 納米抗體
            1.2.1 納米抗體結(jié)構(gòu)特征
            1.2.2 納米抗體的優(yōu)勢
            1.2.3 納米抗體的臨床應(yīng)用
        1.3 本研究的目的與意義
試驗研究
    第二章 PEDV S蛋白特異性納米抗體文庫的構(gòu)建及納米抗體的篩選與鑒定
        2.1 試驗材料
            2.1.1 主要儀器及耗材
            2.1.2 主要試劑
        2.2 試驗方法
            2.2.1 VHH噬菌體展示文庫的構(gòu)建
            2.2.2 PEDV S蛋白特異性納米抗體的篩選
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 雙峰駝免疫
            2.3.2 VHH噬菌體展示文庫的構(gòu)建
            2.3.3 PEDV S蛋白特異性納米抗體的篩選
            2.3.4 PEDV S蛋白納米抗體特異性及效價的測定
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第三章 PEDV S蛋白納米抗體Nb3的表達(dá)、純化及生物素化標(biāo)記
        3.1 試驗材料
            3.1.1 感受態(tài)、載體及主要試劑
            3.1.2 主要儀器
        3.2 試驗方法
            3.2.1 原核表達(dá)載體pET21b-Nb3-Avitag的構(gòu)建
            3.2.2 納米抗體Nb3-Avitag融合蛋白的表達(dá)與可溶性鑒定
            3.2.3 Nb3-Avitag重組蛋白的純化
            3.2.4 Nb3-Avitag融合蛋白的生物素化
            3.2.5 Nb3-Avitag融合蛋白生物素標(biāo)記的效果驗證
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 pET21b-Nb3-Avitag原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.2 重組納米抗體Nb3-Avitag融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)與可溶性鑒定
            3.3.3 Nb3-Avitag融合蛋白的純化
            3.3.4 Nb3-Avitag融合蛋白生物素標(biāo)記的效果驗證
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第四章 基于生物素化納米抗體檢測豬血清中PEDV S蛋白抗體的阻斷ELISA方法的建立
        4.1 試驗材料
        4.2 試驗方法
            4.2.1 摸索最佳抗原包被量與納米抗體稀釋比例
            4.2.2 確定最佳血清稀釋比例
            4.2.3 確定血清最佳孵育時間
            4.2.4 確定Nb3-Biotin最佳孵育時間
            4.2.5 確定酶標(biāo)二抗最佳孵育時間
            4.2.6 阻斷ELISA臨界值的確定
            4.2.7 重復(fù)性評價
            4.2.8 特異性評價
            4.2.9 符合率評價
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 摸索最佳抗原包被量與納米抗體稀釋比例
            4.3.2 確定最佳血清稀釋比例
            4.3.3 確定血清最佳孵育時間
            4.3.4 確定Nb3-Biotin最佳孵育時間
            4.3.5 確定酶標(biāo)二抗最佳孵育時間
            4.3.6 阻斷ELISA臨界值的確定
            4.3.7 重復(fù)性評價
            4.3.8 特異性評價
            4.3.9 符合率評價
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
附錄
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 李亞蘭,袁曉民,湛洋,楊凌宸,胡意,譚磊,劉譚彬,郭時印,王愛兵.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2019(03)
[2]PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立及臨床應(yīng)用[J]. 宋予震,董青,梁中濤,霍軍.  中國獸醫(yī)雜志. 2016(10)
[3]半巢式PCR法構(gòu)建天然噬菌體單域重鏈抗體文庫[J]. 涂追,許楊,何慶華,陶勇.  食品科學(xué). 2010(19)
[4]納米抗體的研究進(jìn)展[J]. 王更如,姜廣水,審閱.  現(xiàn)代免疫學(xué). 2010(01)



本文編號：3282931