本文關(guān)鍵詞：牛布魯氏菌毒力基因VirB5間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人畜共患傳染病,其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎,引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。該病給畜牧業(yè)和人類的健康帶來嚴(yán)重危害。為了建立一種快速準(zhǔn)確的檢測布魯氏菌病抗體的ELISA方法。首先對布魯氏菌病四種血清學(xué)檢測方法進(jìn)行比較分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:RBPT與ELISA,SAT與CFT檢測方法的符合率高達(dá)到95%以上,且Kappa值均大于0.75。以CFT作為判定標(biāo)準(zhǔn),RBPT和ELISA敏感性較好,但有假陽性,SAT的特異性較好,但有假陰性。綜合比較ELISA的敏感性和特異性都比較理想。選擇布魯氏菌四型分泌系統(tǒng)致病力因子VirB5作為候選基因,在GenBank中獲取基因序列,設(shè)計(jì)引物,以牛種布魯氏菌疫苗A19全基因序列為模板,擴(kuò)增得到目的基因,經(jīng)過BamHI和HindIII雙酶切,與pET32a(+)載體鏈接,得到重組質(zhì)粒pET32a(+)-VirB5,經(jīng)測序正確后,轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中,誘導(dǎo)表達(dá)包涵體蛋白pET32a(+)-VirB5。經(jīng)IPTG誘導(dǎo),SDS-PAGE分析,采用Ni柱純化目的蛋白,Western blot鑒定其活性。將純化好的重組蛋白作為包被抗原,確定其最佳包被濃度、包被條件、二抗稀釋度以及陰陽臨界值,初步建立了間接ELISA(VirB5)的檢測方法。用該方法對上述294份牛血清樣本進(jìn)行檢測,并與RBPT和IDEXX的牛布魯氏菌間接ELISA試劑盒進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:本實(shí)驗(yàn)建立的間接ELISA(VirB5)方法與RBPT比較敏感性、特異性和符合率分別為91.30%、89.60%和90.14%,IDEXX的牛布魯氏菌間接ELISA試劑盒比較敏感性、特異性和符合率95.45%、94.17%和94.55%。綜上所述,布魯氏菌病的檢測可以首先使用ELISA方法進(jìn)行初篩,然后通過CFT進(jìn)行確診,兩種血清學(xué)檢測方法聯(lián)合診斷結(jié)果較為理想。本實(shí)驗(yàn)建立的重組蛋白Vir B5間接ELISA方法具有較好的敏感性、特異性和符合率,可以用于臨床布魯氏菌病血清抗體的檢測。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 血清學(xué)檢測 原核表達(dá) 重組蛋白VirB5 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引用縮寫符號(hào)說明10-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-21
• 1.1 布魯氏菌病概述11-12
• 1.2 布魯氏菌病的危害12-13
• 1.3 布魯氏菌病原學(xué)13
• 1.4 布魯氏菌病的診斷13-18
• 1.4.1 病原學(xué)檢測14-18
• 1.4.2 存在的問題及發(fā)展方向18
• 1.5 IV型分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展18-19
• 1.6 本研究的目的與意義19-21
• 第二章 牛布魯氏菌四種血清學(xué)檢測方法的比較分析21-33
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 血清樣品21
• 2.1.2 主要試劑21
• 2.1.3 主要儀器耗材21-22
• 2.1.4 主要溶液配制22
• 2.2 方法22-28
• 2.2.1 RBPT22-23
• 2.2.2 試管凝集實(shí)驗(yàn)23-24
• 2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)24-26
• 2.2.4 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)26-27
• 2.2.5 Kappa值的計(jì)算27-28
• 2.3 結(jié)果28-30
• 2.3.1 四種血清學(xué)檢測陽性率結(jié)果28
• 2.3.2 RBPT與ELISA檢測結(jié)果比較28-29
• 2.3.3 SAT與CFT檢測結(jié)果比較29
• 2.3.4 四種檢測方法相關(guān)性比較29-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-33
• 第三章 牛布魯氏菌VirB5蛋白原核表達(dá)和鑒定33-49
• 3.1 材料33-35
• 3.1.1 菌株、質(zhì)粒和血清33-34
• 3.1.2 工具酶和主要試劑34
• 3.1.3 主要儀器耗材34
• 3.1.4 主要溶液配制34-35
• 3.2 方法35-43
• 3.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成35
• 3.2.2 布魯氏菌DNA的提取35-36
• 3.2.3 VirB5基因的擴(kuò)增36
• 3.2.4 PCR產(chǎn)物的回收36-37
• 3.2.5 重組質(zhì)粒pET32a(+)-VirB5的構(gòu)建37-40
• 3.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)40
• 3.2.7 SDS-PAGE電泳40-41
• 3.2.8 蛋白樣品超聲破碎41-42
• 3.2.9 重組蛋白pET32a(+)-VirB5的純化42-43
• 3.2.10 重組蛋白的Western blot43
• 3.3 結(jié)果43-46
• 3.3.1 VirB5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果43-44
• 3.3.2 pET32a(+)-VirB5重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定44-45
• 3.3.3 重組蛋白VirB5的表達(dá)及純化45
• 3.3.4 表達(dá)蛋白的純化45
• 3.3.5 重組蛋白Western blot鑒定結(jié)果45-46
• 3.4 討論46-49
• 第四章 間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用49-61
• 4.1 材料49-50
• 4.1.1 主要試劑49
• 4.1.2 抗原49
• 4.1.3 血清49
• 4.1.4 主要試劑制備49-50
• 4.2 方法50-52
• 4.2.1 重組抗原間接ELISA方法的建立50-51
• 4.2.2 臨界值的確定51
• 4.2.3 特異性實(shí)驗(yàn)51
• 4.2.4 敏感性實(shí)驗(yàn)51-52
• 4.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)52
• 4.2.6 對比實(shí)驗(yàn)52
• 4.3 結(jié)果52-58
• 4.3.1 最佳抗原包被濃度和血清稀釋度的確定52-53
• 4.3.2 間接ELISA最佳工作條件的確定53-58
• 4.4 討論58-61
• 第五章 全文結(jié)論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-69
• 附錄69-75
• 致謝75-77
• 作者簡歷77

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 齊景文;依穎新;周艷紅;雷蕾;楊蘊(yùn)力;李祺;;牛羊布魯氏菌病四種血清學(xué)檢測方法對比分析[J];中國動(dòng)物檢疫;2015年04期

2 馬臻;;布魯桿菌毒力因子及其致病機(jī)制[J];國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志;2015年01期

3 施旭光;凌鋒;;布魯氏菌病研究進(jìn)展[J];浙江預(yù)防醫(yī)學(xué);2014年06期

4 郭麗;趙虹;;兩種全血基因組DNA提取法的比較[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2013年12期

5 龐志文;;布病的發(fā)生與防控要點(diǎn)[J];吉林農(nóng)業(yè);2013年10期

6 張慧;張喜悅;范偉興;;法國布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室的血清學(xué)檢測方法[J];中國動(dòng)物檢疫;2013年10期

7 張劍;馬衛(wèi)明;張亮;何洪彬;丁家波;楊宏軍;;牛布魯氏菌毒力基因Virb8間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年16期

8 王玉玲;柴銘駿;劉紅梅;;應(yīng)用熒光偏振檢測方法對出口牛進(jìn)行布氏桿菌病檢測[J];中國動(dòng)物檢疫;2012年05期

9 王秀麗;蔣玉文;毛開榮;丁家波;王秋菊;何宇;彭小兵;;布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展[J];中國獸藥雜志;2011年11期

10 王景龍;張瑞;王興龍;;細(xì)菌IV型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2011年23期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳同壘;吳清民;;布魯氏菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白的研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第八屆全國會(huì)員代表大會(huì)暨第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2013年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李建云;動(dòng)物布魯氏菌快速檢測方法的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

2 趙巖;Ⅳ型分泌系統(tǒng)在高致病性2型豬鏈球菌引發(fā)鏈球菌中毒性休克綜合征中作用的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

3 王遠(yuǎn)志;綿羊種布魯氏菌致病的分子機(jī)制研究[D];石河子大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張劍;牛布魯氏菌毒力基因Virb8間接ELISA方法建立與應(yīng)用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 王震;牛種布魯氏菌強(qiáng)弱毒株差異表達(dá)蛋白的功能研究[D];石河子大學(xué);2013年

3 宋軍;布魯氏菌部分體內(nèi)感染因子免疫保護(hù)的研究[D];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 羨東堡;流產(chǎn)布魯氏菌BP26蛋白B細(xì)胞線性表位的鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

5 李彥偉;OIE標(biāo)準(zhǔn)布魯氏菌ELISA和PCR檢測方法在奶牛奶樣中的應(yīng)用研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

6 李博;布魯氏菌PCR檢測方法的應(yīng)用與分子分型研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

7 高洪霞;不同血清學(xué)方法檢測牛羊布魯氏菌疫苗免疫抗體消長規(guī)律的比較研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

8 趙瑾;布魯氏菌抗原快速檢測UPT免疫層析試紙的研制[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2009年

9 王加蘭;光滑型布魯氏菌LPS單克隆抗體的制備及競爭ELISA方法的建立[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2009年

10 姚靜;呼和浩特地區(qū)布魯氏菌的分離鑒定[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

  本文關(guān)鍵詞：牛布魯氏菌毒力基因VirB5間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：325106