發(fā)布時間：2021-06-17 01:45

　　DI03基因在甲狀腺激素代謝過程中發(fā)揮著重要的作用,它對胎兒發(fā)育、新生兒生長有著非常重要的作用,尤其對哺乳動物大腦的發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。為了進一步理解DI03基因的結(jié)構(gòu)和功能,我們從南江黃羊的心肌中分離鑒定出DI03基因,采用實時熒光定量PCR技術(shù)研究南江黃羊在出生后3 d、30 d、60 d、90 d和120 d這5個生長階段DIO3在不同組織中mRNA水平的表達差異。同時應(yīng)用原位雜交技術(shù)對大腦不同區(qū)域的DIO3 mRNA進行了定位分析；此外,采用MassArray甲基化定量檢測方法對出生后3d的南江黃羊不同組織DI03基因內(nèi)部的CpG島的甲基化狀態(tài)進行了檢測。主要結(jié)果如下：（1）克隆得到南江黃羊DI03基因的編碼區(qū)全序列,長度為906 bp,編碼的氨基酸數(shù)目為301個；山羊DI03的編碼序列與小鼠、大鼠、人、豬、綿羊和牛的序列相似度分別為83.61%、84.37%、88.52%、90.20%、90.95%和97.46%；而DI03的編碼氨基酸序列與牛的同源性為98.67%,與小鼠、大鼠、綿羊、人和豬的相似度分別為89.47%、89.80%、92.36%、92.76%和93.11... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 DIO3簡介
    1.2 DIO3的結(jié)構(gòu)和功能
    1.3 DIO3基因的研究進展
    1.4 DNA甲基化
        1.4.1 DNA甲基化的作用因素
        1.4.2 哺乳動物DNA甲基化的特點
        1.4.3 哺乳動物DNA甲基化主要的生物學作用
        1.4.4 DNA甲基化的檢測方法
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料和方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 試驗動物
        2.1.2 主要儀器與試劑
        2.1.3 常用的生物信息學網(wǎng)站和分析軟件
    2.2 試驗方法
        2.2.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測
        2.2.2 cDNA的制備
        2.2.3 基因組DNA的提取
        2.2.4 MassArray甲基化檢測
    2.3 克隆引物設(shè)計
    2.4 DIO3基因的分離及克隆測序
        2.4.1 RT-PCR擴增
        2.4.2 PCR產(chǎn)物的純化回收
        2.4.3 RT-PCR產(chǎn)物的克隆
    2.5 基因組織特異性表達分析
        2.5.1 熒光定量特異性引物設(shè)計
        2.5.2 實時熒光定量PCR
    2.6 DIO3 mRNA局部定位表達分析
        2.6.1 mRNA原位雜交操作步驟
    2.7 甲基化檢測
        2.7.1 甲基化引物設(shè)計
        2.7.2 基因組DNA的重亞硫酸鹽處理
        2.7.3 甲基化PCR擴增
        2.7.4 PCR產(chǎn)物酶切和RNaseA消化
        2.7.5 產(chǎn)物樹脂純化
        2.7.6 甲基化檢測
    2.8 統(tǒng)計分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 總RNA質(zhì)量檢測
    3.2 RT-PCR擴增結(jié)果
        3.2.1 山羊DIO3基因測序結(jié)果
    3.3 生物信息學分析
        3.3.1 序列分析
        3.3.2 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建
        3.3.3 山羊DIO3蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
        3.3.4 DIO3蛋白3D結(jié)構(gòu)模型預(yù)測
    3.4 DIO3 mRNA組織特異性表達分析
        3.4.1 實時熒光定量PCR引物驗證
        3.4.2 標準曲線的建立
        3.4.3 熒光定量PCR擴增產(chǎn)物的特異性
        3.4.4 山羊DIO3 mRNA的組織特異性表達差異
        3.4.5 山羊DIO3 mRNA表達的發(fā)育性變化
    3.5 DIO3 mRNA在大腦的定位表達分析
    3.6 甲基化定量分析
        3.6.1 基因組DNA的檢測
        3.6.2 DIO3基因內(nèi)CpG島的預(yù)測分析
        3.6.3 甲基化結(jié)果檢測
4 討論
    4.1 克隆的cDNA序列分析
    4.2 DIO3蛋白功能和理化特性分析
    4.3 DIO3 mRNA組織特異性表達分析
    4.4 大腦不同區(qū)域的定位表達分析
    4.5 不同組織基因組DNA甲基化分析
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄



本文編號：3234208