本文關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒（RHDV）與兔出血癥病毒2型（RHDV2）的RT-PCR檢測(cè)方法研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：兔病毒性出血癥(rabbit hemorrhagic disease, RHD),俗稱兔瘟,是由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus, RHDV)引起的兔的一種急性、高度致死性傳染病。RHD以呼吸系統(tǒng)出血,實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血和肝臟壞死為主要病變特征,主要危害2月齡以上的養(yǎng)殖和野生的多個(gè)穴兔品種,死亡率達(dá)80%-100%。RHD于1984年被我國(guó)首次報(bào)道后,在世界很多國(guó)家出現(xiàn)發(fā)病和流行的報(bào)道,嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展,被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織列為法定通過動(dòng)物疫病。2010年在法國(guó)出現(xiàn)了由RHDV新種即兔出血癥病毒2型(rabbit hemorrhagic disease virus 2, RHDV2)引起的能感染致死30日齡以內(nèi)的兔r和傳統(tǒng)RHDV毒株滅活苗的免疫過的兔子的新型兔病毒性出血癥(new rabbit hemorrhagic disease, nRHD),也稱為兔病毒性出血癥2型(rabbit hemorrhagic disease type 2, RHD2)近年來RHD2已擴(kuò)散至意大利、西班牙、德國(guó)、葡萄牙、英國(guó)、挪威等多數(shù)西歐國(guó)家和亞速爾群島等國(guó)。我國(guó)目前尚無(wú)該病發(fā)生及其相關(guān)的研究報(bào)道,為此本研究在對(duì)RHDV2和RHDV基因序列分析基礎(chǔ)上對(duì)其RT-PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了初步研究,具體如下：為建立用于兔出血癥病毒2型(RHDV2)的快速檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank已公布的RHDV和RHDV2 VP60基因,設(shè)計(jì)合成2對(duì)特異性引物和10條搭橋引物,通過搭橋PCR人工合成RHDV2 VP60基因中保守區(qū)片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并以其為模板,經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和35份樣品檢測(cè)應(yīng)用,初步建立RHDV2 RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明成功合成RHDV2 VP60基因的435 bp保守片段和構(gòu)建了pMD-19T-RHDV2重組質(zhì)粒以及pMD-19T-RHDV441,初步建立的RHDV2 RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性,RHDV2的檢測(cè)限度可達(dá)到230個(gè)拷貝的靶基因片段,檢測(cè)RHDV、pGM-T-EBHSV(已構(gòu)建)、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌均無(wú)特異性擴(kuò)增。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示樣品中RHDV2核酸陰性。為建立用于兔出血癥病毒(RHDV)與兔出血癥病毒2型(RHDV2)鑒別診斷的檢測(cè)方法,根據(jù)GenBank已公布的RHDV和RHDV2的VP60基因,在上面研究的基礎(chǔ)上又設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性引物,采用RT-PCR和搭橋PCR技術(shù)分別獲取RHDV和RHDV2的VP60基因中保守區(qū)片段,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-19T-RHDV2、 pMD-19T-RHDV441(上面已構(gòu)建)和pMD-19T-RHDV294,并以其為模板,經(jīng)過反應(yīng)條件優(yōu)化、敏感性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn),以及人工感染RHDV樣品和臨床樣品的應(yīng)用,對(duì)RHDV與RHDV2的復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了初步研究。結(jié)果顯示建立的RHDV與RHDV2復(fù)合RT-PCR方法具有良好的特異性和敏感性,可分別擴(kuò)增山RHDV和RHDV2的VP60保守區(qū)基因片段大小為294 bp和435 bp, RHDV與RHDV2的檢測(cè)限度分別為160和230個(gè)拷貝的靶基因片段,而pGM-T-EBHSV(已構(gòu)建)、兔源巴氏桿菌、兔源大腸桿菌和兔源沙門氏菌等病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示人工感染樣品的RHDV檢出率為100%(5/5),30份臨床檢樣RHDV和RHDV2檢測(cè)結(jié)果均為陰性。本研究為我國(guó)進(jìn)行RHDV2的防控提供了一種技術(shù)儲(chǔ)備和奠定了基礎(chǔ),同時(shí)為RHDV和RHDV2的鑒別與流行病學(xué)調(diào)查提供了科學(xué)方法和科學(xué)參考。
【關(guān)鍵詞】：兔病毒性出血癥 RHDV RHDV2 RT-PCR 搭橋PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.291
【目錄】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 綜述部分10-24
• 第一章 兔出血癥病毒及其檢測(cè)技術(shù)10-24
• 1.1 兔瘟病毒(RHDV)10-17
• 1.1.1 結(jié)構(gòu)特征11-14
• 1.1.1.1 病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)11
• 1.1.1.2 基因組結(jié)構(gòu)特征與病毒蛋白11-14
• 1.1.2 理化特征與培養(yǎng)特性14
• 1.1.3 分類地位與分型14-16
• 1.1.3.1 分類地位14-15
• 1.1.3.2 毒株分型15-16
• 1.1.4 病毒的起源16-17
• 1.2 RHDV檢測(cè)診斷技術(shù)17-22
• 1.2.1 初診17-18
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)診斷技術(shù)18-22
• 1.2.2.1 電鏡技術(shù)18
• 1.2.2.2 血凝-血凝抑制試驗(yàn)(HA-HIA)18-19
• 1.2.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)19-20
• 1.2.2.4 分子生物學(xué)技術(shù)20-22
• 1.3 本研究的目的意義22-24
• 試驗(yàn)研究24-42
• 第二章 兔出血癥病毒2型VP60基因保守區(qū)人工合成及RT-PCR檢測(cè)方法初探24-34
• 2.1 材料與方法24-29
• 2.1.1 試劑與樣品24-25
• 2.1.2 引物設(shè)計(jì)25-26
• 2.1.3 RHDV2 VP60基因靶片段的人工合成26-28
• 2.1.3.1 搭橋PCR26-27
• 2.1.3.2 目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建27-28
• 2.1.4 RHDV VP60基因靶片段的克隆鑒定28
• 2.1.5 反應(yīng)條件的優(yōu)化28
• 2.1.6 RHDV2 RT-PCR敏感性試驗(yàn)28
• 2.1.7 RHDV2 RT-PCR特異性試驗(yàn)28
• 2.1.8 初步應(yīng)用試驗(yàn)28-29
• 2.2 結(jié)果29-32
• 2.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鑒定29-31
• 2.2.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化31
• 2.2.3 RHDV2 RT-PCR的敏感性和特異性31-32
• 2.2.4 樣品檢測(cè)32
• 2.3 討論32-34
• 第三章 兔出血癥病毒與兔出血癥病毒2型復(fù)合RT-PCR檢測(cè)方法的初步研究34-42
• 3.1 材料與方法34-36
• 3.1.1 試劑與樣品34-35
• 3.1.2 引物設(shè)計(jì)35
• 3.1.3 RHDV與RHDV2靶基因片段的克隆鑒定35-36
• 3.1.3.1 RHDV2 VP60靶基因片段的人工合成35
• 3.1.3.2 RHDV VP60基因靶片段的擴(kuò)增35
• 3.1.3.3 RHDV2與RHDV靶基因片段的克隆鑒定35-36
• 3.1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化36
• 3.1.5 復(fù)合RT-PCR敏感性試驗(yàn)36
• 3.1.6 復(fù)合RT-PCR特異性試驗(yàn)36
• 3.1.7 初步應(yīng)用試驗(yàn)36
• 3.2 結(jié)果36-40
• 3.2.1 RHDV2和RHDV靶基因片段的克隆鑒定36-38
• 3.2.2 反應(yīng)條件的確立38
• 3.2.3 復(fù)合RT-PCR的敏感性和特異性38-40
• 3.2.4 樣品檢測(cè)40
• 3.3 討論40-42
• 結(jié)論部分42-43
• 第四章 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 致謝48-49
• 個(gè)人簡(jiǎn)介49

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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  本文關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒（RHDV）與兔出血癥病毒2型（RHDV2）的RT-PCR檢測(cè)方法研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：322762