水貂阿留申病（Aleutian Mink Disease,AD）又稱水貂漿細(xì)胞增多癥（Plasmacytosis）是由水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Virus,AMDV）感染引起水貂自身免疫系統(tǒng)功能紊亂的慢性、傳染性疾病。該病的典型特征為漸進(jìn)性消瘦、繁殖力下降、血清γ球蛋白增多、脾臟腫大、腎臟改變（從腫脹和瘀點(diǎn)到萎縮和凹陷）和腸系膜淋巴結(jié)腫大。AMDV可通過水平和垂直方式傳播,引起母貂自然流產(chǎn)和仔貂死亡,能明顯影響水貂繁殖性能和毛皮質(zhì)量,AD是影響水貂養(yǎng)殖業(yè)的三大疫病之一。目前仍沒有可用于預(yù)防的疫苗,也無可以徹底根治的治療方案,只有通過定期的檢疫、淘汰,達(dá)到逐步凈化貂群的目的。因此,探索建立靈敏、高效、準(zhǔn)確的診斷方法,開展流行病學(xué)調(diào)查以及針對(duì)AMDV開展分子生物學(xué)研究是非常必要的。本研究根據(jù)AMDV的VP2基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和探針,建立熒光定量PCR檢測(cè)方法,標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.0×102拷貝/μL至1.0×108拷貝/μL之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.994,該方法檢測(cè)的靈敏度為102拷貝/μL,且與犬細(xì)小病毒、犬腺病毒、犬瘟熱... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

AMDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章AMDVVP2基因TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用10表2-1引物和探針的序列Table2-1Thesequencesofprimersandprobe引物Primers引物序列(5’-3’)Primersequences(5"to3")片段大小ProductLength/bp退火溫度AnnealingTemperature/℃AMDV-qPCR-FCGTTACAGGTTGCTTTAGATACTATTGGGTTGGTTTGGT10960AMDV-qPCR-RAMDV-qPCR-ProbeCCGTTGGGGGAAACACTGGGCT圖2-1引物及探針設(shè)計(jì)示意圖Fig.2-1Schematicdiagramofprimersandprobedesign2.2.2質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備利用拯救AMDV-G株病毒的全基因合成重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品用于熒光定量PCR方法的建立，ADV-G株基因組GenBank號(hào)為M20036，病毒全基因亞克隆到pUC-19載體，命名為pUC-AMDV-G，由北京六合華大基因科技有限公司合成。提取質(zhì)粒后，分光光度法測(cè)出其濃度，通過計(jì)算公式得出相應(yīng)的拷貝數(shù)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品，保存于-20℃。2.2.3熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化把將引物和探針稀釋至10μM，反應(yīng)共20μL的體系，在1μL探針條件下，進(jìn)行TaqMan熒光定量PCR反應(yīng)，依據(jù)Ct值及曲線形狀不斷優(yōu)化上下游引物工作濃度。再以相同濃度重組質(zhì)粒為模板，利用優(yōu)化的上下游引物濃度，對(duì)探針加入量(0.2μL、0.4μL、0.8μL)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳探針工作濃度。2.2.4熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立將標(biāo)準(zhǔn)品10倍稀釋，以108為起始濃度，使用108至102拷貝/μL的質(zhì)粒作為模板，并設(shè)置陰性對(duì)照，熒光定量PCR擴(kuò)增使用3.2.3中優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行，這7個(gè)濃度各重復(fù)三次，獲得動(dòng)力學(xué)曲線，依據(jù)反應(yīng)的Ct值及質(zhì)粒的拷貝數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方程。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第二章AMDVVP2基因TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用12拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)(拷貝/μL)=(6.02×1023×稀釋倍數(shù)×OD值×10-9)/(660×堿基數(shù))，使用分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品OD值為：280ng/μL。代入公式可得出結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)約為3.04×1010拷貝/μL。2.3.2熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化優(yōu)化后的反應(yīng)體系(20μL)中含有：試劑體積(μL)2×TransStartProbeqPCRSuperMix10Nuclease-freeWater7.8探針(10μM)0.4上下游引物(10μM)各0.4模板1優(yōu)化后確定反應(yīng)條件為：94℃30s；94℃5s，60℃30s，45個(gè)循環(huán)。2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立模板選用108~102拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)重復(fù)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增曲線，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，橫縱坐標(biāo)分別為各個(gè)濃度拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)及其對(duì)應(yīng)的Ct值，曲線方程為：Y=-3.456x+40.488，其相關(guān)系數(shù)（r2）為0.994（圖2-2）。結(jié)果表明，在所選稀釋度范圍內(nèi)，Ct值與拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。圖2-2ADV熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2-2ThestandardcurveofADVrealtimePCR2.3.4敏感性試驗(yàn)結(jié)果以10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，選擇范圍為1.0×108拷貝/μL~1.0×101拷貝/μL，應(yīng)用本研究建立熒光定量PCR方法測(cè)試其敏感性，以ddH2O為模板作為陰性對(duì)照，以Ct<35且出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的S

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水貂阿留申病診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 韋韜,吳艷虹,叢麗,趙永強(qiáng),馬瑞芳,邵西群.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2019(06)
[2]水貂阿留申病的檢疫方法[J]. 黃海嬌.  畜牧獸醫(yī)科技信息. 2018(11)
[3]水貂阿留申病診斷技術(shù)的進(jìn)展[J]. 李俚,胡哲,孫金輝,關(guān)東嵩,方孟頎,王曉鈞,路義鑫.  中國獸醫(yī)雜志. 2018(11)
[4]小反芻獸疫病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 付明哲,楊峰,郝玉青,許信剛,張琪.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2018(11)
[5]復(fù)方中草藥添加劑抗水貂阿留申病的研究[J]. 周貴凱,馬澤芳,崔凱,李建棟.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2018(22)
[6]水貂阿留申病毒檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 劉藝,冷雪,時(shí)坤,李健明,曾范利,宗穎,宮慶龍,張姍姍,孫志博,劉亞東,杜銳.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2018(10)
[7]基于B細(xì)胞表位肽的水貂阿留申病毒抗體ELISA檢測(cè)方法的建立及其在流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用[J]. 孫殿鋼,雷連成,黃盼盼,劉洪濤,楊柳枝,劉建方,馮新,孫長江.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(06)
[8]兩株水貂阿留申全基因重組核酸疫苗的免疫效果初步評(píng)估[J]. 孫利杰,劉東旭,李健明,冷雪,時(shí)坤,李東,杜銳.  中國獸藥雜志. 2017(12)
[9]水貂阿留申病毒、腸炎病毒與犬瘟熱病毒多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 馬芹,王元智,閆文卓,趙麗麗,陳洪巖,陸濤峰.  中國比較醫(yī)學(xué)雜志. 2017(12)
[10]水貂阿留申病毒最新檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 莊金秋,梅建國,王玉茂,姚春陽,莫玲,沈志強(qiáng).  現(xiàn)代畜牧獸醫(yī). 2017(11)

博士論文
[1]新型水貂阿留申病毒感染性克隆的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定[D]. 郗冀.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016

碩士論文
[1]水貂阿留申疾病的雙重PCR檢測(cè)方法建立及其應(yīng)用[D]. 滕傳杰.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]水貂阿留申病毒雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[D]. 王元智.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2017
[3]水貂阿留申病毒VP2基因的原核表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立[D]. 劉立兵.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3216027