豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒屬,冠狀病毒科,能夠?qū)е伦胸i嚴(yán)重腹瀉,給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。S蛋白作為PEDV最主要的膜蛋白,已有報道證實S蛋白含有病毒感染細(xì)胞的抗原表位區(qū),但關(guān)于S蛋白介導(dǎo)PEDV進入細(xì)胞還有待于進一步研究,故本主要通過構(gòu)建PEDV S1的偽型病毒研究富含抗原表位區(qū)的S1蛋白在PEDV進入細(xì)胞中的作用。本研究中,首先,為有效的檢測PEDV,利用Vero E6繁殖的PEDV做為抗原,制備PEDV全病毒多克隆抗體。利用ELISA和間接免疫熒光對抗體的效價和特異性進行檢測,結(jié)果顯示該多克隆抗體與PEDV有很好的特異性反應(yīng)。其次,為研究PEDV的感染特性,摒棄非同源細(xì)胞系,對PEDV在豬小腸上皮細(xì)胞（IEC）上進行適應(yīng)培養(yǎng),通過在IEC細(xì)胞中盲傳10代,對第10代病毒液進行檢測。反轉(zhuǎn)錄PCR、間接免疫熒光和電鏡檢查均證PEDV能夠感染IEC細(xì)胞系,并穩(wěn)定傳代,故最終確定1EC是PEDV的易感細(xì)胞系。再次,為研究PEDV S1蛋白功能,構(gòu)建S1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒,建立穩(wěn)定表達(dá)S1蛋白的BHK-21細(xì)胞系,命名為BHK-S1。反轉(zhuǎn)錄PCR和間接免疫熒光鑒定,成功構(gòu)建... 

【文章來源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 PEDV的根源
    1.2 PED流行病學(xué)
    1.3 PEDV基因結(jié)構(gòu)
    1.4 PEDV主要結(jié)構(gòu)蛋白功能
    1.5 PEDV非結(jié)構(gòu)蛋白功能
    1.6 PEDV細(xì)胞表面受體研究進展
    1.7 PEDV繁殖與裝配
    1.8 假病毒研究進展
    1.9 研究目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 毒株、細(xì)胞、工程菌以及質(zhì)粒
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 實驗主要試劑
        2.1.4 試劑配制
        2.1.5 主要儀器設(shè)備
    2.2 試驗方法
        2.2.1 PEDV全病毒多克隆抗體的制備
        2.2.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效價檢測
        2.2.3 PEDV感染靶細(xì)胞豬小腸上皮細(xì)胞(IEC)
        2.2.4 PEDV S1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 PEDV偽型病毒VSVAG*PEDV S1的構(gòu)建
        2.2.6 利用PEDV偽型病毒對被感染IEC細(xì)胞中S1蛋白的定位研究
3 實驗結(jié)果
    3.1 PEDV多克隆抗體制備
        3.1.1 PEDV繁殖培養(yǎng)
        3.1.2 PEDV梯度密度離心
    3.2 PEDV全病毒多抗的生物活性及效價檢測
        3.2.1 間接ELISA檢測
        3.2.2 間接免疫熒光檢測
    3.3 PEDV感染靶細(xì)胞IEC
        3.3.1 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測
        3.3.2 間接免疫熒光檢測
        3.3.3 電鏡檢測
    3.4 PEDV S1真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.4.1 酶切獲取PEDV S1片段
        3.4.2 鑒定pcDNA3.1-PEDV S1
    3.5 PEDV偽型病毒VSVΔG~*PEDV S1的構(gòu)建
        3.5.1 穩(wěn)定表達(dá)S1細(xì)胞系的建立
        3.5.2 PEDV偽型病毒VSVΔG~*S1的鑒定
    3.6 利用PEDV偽型病毒對被感染IEC細(xì)胞中S1蛋白的定位研究
4 討論
    4.1 PEDV全病毒多克隆抗體的制備
    4.2 PEDV感染IEC細(xì)胞的研究
    4.3 PEDV S1蛋白指導(dǎo)PEDV偽型病毒進入細(xì)胞
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒全基因組序列分析及感染性cDNA克隆的構(gòu)建[D]. 陳建飛.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012

碩士論文
[1]豬流行性腹瀉病毒S1蛋白親和肽的篩選與鑒定[D]. 楊巍.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[2]豬病毒性腹瀉多重RT-PCR診斷方法的建立和應(yīng)用及豬輪狀病毒的分離[D]. 張坤.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[3]豬流行性腹瀉病毒S蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及間接ELISA抗體檢測方法的初步建立[D]. 熊靜.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3215964