本研究以胞內(nèi)勞森氏菌陽性豬回腸粘膜DNA為模板,通過PCR和Nested-PCR的方法擴增出胞內(nèi)勞森氏菌四個抗原候選蛋白（即外膜蛋白OMP1022、外膜蛋白OMP0902、外膜蛋白OMP1024和表面脂蛋白SLP0235）的基因序列,并分別構(gòu)建T-A克隆質(zhì)粒,再亞克隆到原核表達載體pET-32a（+）中得到原核表達質(zhì)粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235,酶切鑒定及序列測定表明,重組表達質(zhì)粒構(gòu)建正確。將原核表達質(zhì)粒pET32a-OMP1022、pET32a-OMP0902、 pET32a-OMP1024和pET32a-SLP0235轉(zhuǎn)入宿主表達菌BL-21（DE3）中,IPTG誘導(dǎo)表達,重組蛋白1022和0902獲得表達,而重組蛋白1024和0235末表達或表達量過低。分兩段擴增OMP1024,得到1024a和1024b,并構(gòu)建得到原核表達質(zhì)粒pET32a-OMP1024a和pET32a-OMP1024b,轉(zhuǎn)入宿主表達菌BL-21（DE3）中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均得到表達。Western-blot證實重組... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
第一部分 綜述
    1.1 胞內(nèi)勞森氏菌病原學(xué)
        1.1.1 胞內(nèi)菌形態(tài)學(xué)與分類
        1.1.2 培養(yǎng)
        1.1.3 流行病學(xué)
    1.2 致病性
    1.3 病理變化
    1.4 致病機理
    1.5 免疫反應(yīng)
    1.6 診斷
        1.6.1 臨床診斷
        1.6.2 剖檢診斷
        1.6.3 活體診斷
    1.7 預(yù)防與控制
        1.7.1 抗菌藥物
        1.7.2 疫苗免疫
    1.8 目的與意義
    1.9 研究線路
第二部分 實驗研究
    研究一 豬胞內(nèi)勞森氏菌抗原候選蛋白的原核表達及重組蛋白的純化與復(fù)性
        1 主要材料、試劑與儀器
            1.1 材料、菌種及載體
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器設(shè)備
            1.4 引物合成與序列測定
            1.5 主要試劑和培養(yǎng)基的配制
        2 實驗方法與步驟
            2.1 抗原候選蛋白的篩選
            2.2 引物
            2.3 DNA的抽提
            2.4 PCR擴增與目的基因回收
            2.5 目的基因克隆
            2.6 原核表達載體的構(gòu)建
            2.7 重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主菌
            2.8 誘導(dǎo)表達及鑒定
            2.9 重組蛋白的純化及復(fù)性
        3. 結(jié)果
            3.1 豬胞內(nèi)勞森氏菌的診斷
            3.2 抗原候選蛋白原核表達載體的構(gòu)建
            3.3 重組蛋白的表達與鑒定
            3.4 重組蛋白的純化與復(fù)性
        4. 討論
            4.1 間接ELISA檢測方法建立意義
            4.2 胞內(nèi)勞森氏菌外膜蛋白的抗原性
            4.3 抗原候選蛋白的選擇
            4.4 原核表達系統(tǒng)的選擇
            4.5 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.6 重組蛋白的表達形式
            4.7 重組蛋白的獲得
            4.8 包被抗原的確定
        5. 小結(jié)
    研究二 豬胞內(nèi)勞森氏菌間接ELSIA檢測方法的建立及初步應(yīng)用
        1. 材料、試劑與儀器
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
        2. 方法與步驟
            2.1 間接ELISA的基本步驟
            2.2 間接ELlSA的優(yōu)化
            2.3 間接ELISA陰陽性臨界值
            2.4 LI-1024b-ELSIA特異性實驗
            2.5 重復(fù)性試驗
            2.6 LI-1024b間接ELISA檢測方法的初步應(yīng)用
        3 結(jié)果
            3.1 ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果
            3.2 LI-1024b間接ELISA陰陽性臨界值的確定
            3.3 LI-1024b-ELSIA特異性試驗
            3.4 重復(fù)性試驗
            3.5 臨床樣品的檢測
        4. 討論
            4.1 間接ELISA的優(yōu)點
            4.2 間接ELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化
            4.3 LI-1024b間接ELISA的特異性
            4.4 臨床血清樣品檢測結(jié)果
        5. 小結(jié)
第三部分 全文結(jié)論
參考文獻
附錄：英文縮寫對照表
致謝
攻讀碩士期間發(fā)表論文情況



本文編號：3192664