發(fā)布時(shí)間：2021-05-12 08:11

　　外泌體是一種細(xì)胞分泌的起源于內(nèi)體的胞外小囊泡,外泌體可以介導(dǎo)胞內(nèi)蛋白、mRNA、miRNA的細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn),這些外泌體中所包含的分子可在一定程度上調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的生理活動(dòng)。有研究報(bào)道了病毒或病毒RNA可以借助外泌體在細(xì)胞間傳播,以此逃避宿主免疫系統(tǒng)的識(shí)別與清除。口蹄疫病毒是一種單股正鏈RNA病毒,病毒在與受體結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部并在內(nèi)體中釋放出病毒RNA。外泌體起源于內(nèi)體,在空間上外泌體的起源與病毒的復(fù)制周期存在交叉點(diǎn)。首先,從細(xì)胞培養(yǎng)液中富集了細(xì)胞感染病毒后所分泌的外泌體。在獲得外泌體樣品后,分別利用透射電鏡觀察外泌體,免疫印跡分析外泌體標(biāo)志物以及納米粒徑測(cè)定樣品粒徑范圍,證實(shí)獲得了較高純度的外泌體樣品。在將外泌體樣品孵育細(xì)胞后,我們觀察到細(xì)胞發(fā)生了類似口蹄疫病毒感染造成的細(xì)胞病變,并且在細(xì)胞中可以檢測(cè)到病毒蛋白的存在。在使用外泌體生成抑制劑處理細(xì)胞后,我們發(fā)現(xiàn)外泌體中病毒的拷貝數(shù)隨著外泌體的抑制明顯減少。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外泌體可以攜帶病毒的感染性成分。從感染了口蹄疫病毒的細(xì)胞所分泌的外泌體中提取總RNA,然后利用PCR技術(shù)能夠擴(kuò)增到病毒的基因組全長(zhǎng)。利用RNA原位雜交技術(shù),在共聚焦顯微鏡下可... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：50 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
主要符號(hào)對(duì)照表
第一章 緒論
    1.1 外泌體研究進(jìn)展
        1.1.1 外泌體的來(lái)源
        1.1.2 外泌體富集與鑒定方法
        1.1.3 外泌體中所包含的成分
        1.1.4 外泌體的功能
    1.2 口蹄疫與口蹄疫病毒研究進(jìn)展
        1.2.1 口蹄疫
        1.2.2 口蹄疫病毒病原學(xué)
        1.2.3 宿主細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒的抵抗作用
    1.3 外泌體在病毒感染中的研究進(jìn)展
        1.3.1 外泌體攜帶病毒感染性成分進(jìn)行傳播
        1.3.2 病毒借助外泌體進(jìn)行傳播時(shí)的特點(diǎn)
    1.4 研究目的與意義
第二章 外泌體的富集與鑒定
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        2.1.2 主要儀器及設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞傳代培養(yǎng)
        2.2.2 FMDV感染細(xì)胞
        2.2.3 外泌體的富集
        2.2.4 透射電鏡觀察負(fù)染外泌體樣品的制備
        2.2.5 SDS-PAGE電泳相關(guān)制品的配制
        2.2.6 免疫印跡驗(yàn)證外泌體的標(biāo)志蛋白
        2.2.7 外泌體樣品的納米粒徑范圍的測(cè)定
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 透射電鏡下可觀察外泌體
        2.3.2 免疫印跡法可以檢測(cè)到外泌體的標(biāo)志蛋白
        2.3.3 樣品的粒徑范圍符合外泌體樣品的粒徑范圍
    2.4 討論
第三章 外泌體攜帶FMDV感染性成分感染靶細(xì)胞
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        3.1.2 主要儀器及設(shè)備
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 細(xì)胞孵育外泌體
        3.2.2 外泌體的抑制實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.1 抑制劑處理細(xì)胞
            3.2.2.2 外泌體中總RNA的提取
            3.2.2.3 細(xì)胞總RNA的提取
            3.2.2.4 絕對(duì)定量法測(cè)定各組樣品中的病毒RNA拷貝數(shù)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 細(xì)胞孵育外泌體后造成細(xì)胞感染
        3.3.2 病毒隨著外泌體分泌的抑制而減少
    3.4 討論
第四章 病毒RNA借助外泌體進(jìn)行傳播
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        4.1.2 主要儀器及設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 RT-PCR擴(kuò)增病毒基因組
            4.2.1.1 引物設(shè)計(jì)
            4.2.1.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟
            4.2.1.3 核酸電泳實(shí)驗(yàn)
        4.2.2 RNA-FISH實(shí)驗(yàn)
        4.2.3 復(fù)制子轉(zhuǎn)移試驗(yàn)
            4.2.3.1 亞基因組復(fù)制子的結(jié)構(gòu)
            4.2.3.2 利用酶切位點(diǎn)將質(zhì)粒線性化
            4.2.3.3 回收質(zhì)粒模板
            4.2.3.4 復(fù)制子RNA的體外轉(zhuǎn)錄
            4.2.3.5 復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞
            4.2.3.6 SGR-exosome孵育細(xì)胞
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 外泌體樣品中可以擴(kuò)增到病毒的基因組全長(zhǎng)
        4.3.2 病毒RNA可以與外泌體標(biāo)志蛋白共定位
        4.3.3 外泌體攜帶病毒RNA傳播是結(jié)構(gòu)蛋白非依賴性的
    4.4 討論
第五章 外泌體對(duì)中和抗體的逃避作用
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與材料
        5.1.2 主要儀器及設(shè)備
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 中和抗體與外泌體與口蹄疫病毒作用
        5.2.2 噬斑實(shí)驗(yàn)
        5.2.3 中和抗體存在條件下FMDV的傳播
        5.2.4 TCID_50的測(cè)定
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 噬斑實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.2 中和抗體不能阻斷外泌體介導(dǎo)的FMDV傳播
    5.4 討論
第六章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬黑色素瘤分化相關(guān)基因5（MDA5）對(duì)口蹄疫病毒感染宿主的影響[J]. 常興妮,崔曉蕊,孫鵬,馬凱凱,胡高維,楊建設(shè),丁艷平,李志勇.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2017(06)
[2]我國(guó)口蹄疫流行現(xiàn)狀與控制策略[J]. 何繼軍,郭建宏,劉湘濤.  中國(guó)動(dòng)物檢疫. 2015(06)
[3]負(fù)載重組口蹄疫病毒VP4蛋白的樹(shù)突狀細(xì)胞啟動(dòng)的T細(xì)胞應(yīng)答[J]. 安鵬麗,李娜,李麗敏,張麗,張雷,高云歡,王家鑫.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2012(10)



本文編號(hào)：3183068