偽狂犬�。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的可感染多種哺乳動(dòng)物的急性傳染病。豬是PRV的自然宿主,感染可造成懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎,新生仔豬急性死亡。PRV屬于皰疹病毒科,具有皰疹病毒粒子的典型結(jié)構(gòu),其中,被膜層是一個(gè)復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò),位于衣殼和囊膜之間。由UL37、UL48、UL49基因分別編碼的被膜蛋白pUL37、VP16、VP22在病毒復(fù)制及裝配中執(zhí)行著不同的生物學(xué)功能,研究這些蛋白的功能對(duì)新的抗病毒靶點(diǎn)篩選具有重要意義。然而,對(duì)這些蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定位的方法還沒(méi)有建立起來(lái)。本研究,首先將UL49、UL48、UL37基因分別克隆到真核表達(dá)載體pCAGGS,并采用KCl染色切膠法純化原核表達(dá)的蛋白。分別用真核質(zhì)粒和純化的蛋白作為抗原,對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行3次免疫。通過(guò)細(xì)胞融合及單抗特性鑒定試驗(yàn)獲得1株穩(wěn)定分泌VP22蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株3D6;2株穩(wěn)定分泌VP16蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株1D4、4B6;3株穩(wěn)定分泌pUL37蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株1E2、2G2、11C3。間接免疫熒光（IFA）和Wester... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 前言
    1.1 偽狂犬病病毒
        1.1.1 概述
        1.1.2 病毒粒子形態(tài)學(xué)
        1.1.3 偽狂犬病毒的基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.4 偽狂犬病毒的結(jié)構(gòu)蛋白及其功能
        1.1.5 皰疹病毒被膜蛋白的研究進(jìn)展
        1.1.6 流行病學(xué)
    1.2 免疫電鏡研究方法
    1.3 本研究的目的及意義
第二章 UL49、UL48和UL37基因的克隆及表達(dá)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒和毒株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
        2.1.4 主要溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成
        2.2.2 PRV全基因的提取
        2.2.3 UL49、UL48和UL37基因的PCR擴(kuò)增
        2.2.4 UL49、UL48和UL37基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.5 UL48和UL37原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.2.6 VP16和pUL37蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.7 VP16和pUL37蛋白的純化
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 UL49、UL48和UL37基因的擴(kuò)增
        2.3.2 真核重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定
        2.3.3 IFA鑒定真核重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
        2.3.4 原核重組質(zhì)粒pET-28a-UL48/UL37的雙酶切鑒定
        2.3.5 原核蛋白Vp16和pUL37的誘導(dǎo)表達(dá)
    2.4 討論
第三章 VP22、VP16、pUL37蛋白單克隆抗體的制備及單抗特性的鑒定
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 主要溶液的配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 病毒培養(yǎng)與純化
        3.2.2 間接ELISA方法的建立
        3.2.3 小鼠免疫
        3.2.4 SP2/0細(xì)胞的復(fù)蘇
        3.2.5 飼養(yǎng)層細(xì)胞及脾細(xì)胞的制備
        3.2.6 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選與克隆
        3.2.7 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的凍存
        3.2.8 單克隆抗體腹水的制備
        3.2.9 間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性
        3.2.10 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)
        3.2.11 VP22、VP16和pUL37單抗的Western-blot鑒定
        3.2.12 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定
        3.2.13 VP22、VP16和pUL37單抗的IFA鑒定
        3.2.14 染色體計(jì)數(shù)試驗(yàn)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 間接ELISA方法的建立
        3.3.2 細(xì)胞融合觀察
        3.3.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選
        3.3.4 間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性
        3.3.5 單克隆抗體亞類(lèi)的鑒定
        3.3.6 ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)
        3.3.7 Western-blot鑒定單克隆抗體的特異性
        3.3.8 IFA鑒定單克隆抗體的特異性
        3.3.9 雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)的檢測(cè)
    3.4 討論
第四章 免疫電鏡方法的建立
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 PRVHLJ-2013病毒毒價(jià)的測(cè)定
        4.2.2 免疫條件的優(yōu)化
        4.2.3 免疫樣品的制備
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 PRVHLJ-2013株病毒滴度的測(cè)定
        4.3.2 細(xì)胞病變時(shí)間的篩選
        4.3.3 一抗的篩選
        4.3.4 一抗稀釋倍數(shù)的優(yōu)化
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3182470