鴨瘟是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,該病對鴨、鵝、天鵝等造成的高發(fā)病率和高死亡率特征使其嚴(yán)重危害水禽業(yè)發(fā)展。本研究工作目的在于明確鴨瘟病毒（DPV） gC基因介導(dǎo)對宿主細(xì)胞的吸附特性,以及構(gòu)建鴨瘟病毒gC^-/TK^-雙基因缺失病毒株。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1.鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的吸附感染宿主細(xì)胞特性研究通過比較實驗室前期構(gòu)建的重組鴨瘟病毒gC缺失株（DPV-△gC-EGFP）與親本株（DPV-CHv）對鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF）吸附能力的差異及細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素（HS）在其中的作用,探討鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的吸附感染宿主細(xì)胞的特性。首先,建立基于EGFP基因定量PCR檢測DPV-△gC-EGFP和基于gC基因定量PCR檢測DPV-CHv病毒DNA拷貝數(shù)的方法,檢測病毒在DEF不同吸附時間和吸附1h后不同增殖時間病毒DNA拷貝數(shù)的差異,分析gC基因?qū)Σ《疚降挠绊憽＝Y(jié)果DPV-△gC-EGFP和DPV-CHv均隨著時間的延長病毒吸附量增加且于90 min時病毒吸附含量達峰值而穩(wěn)定,各時間點DPV-CHv吸附細(xì)胞的病毒量均高于DPV-△gC-EGF... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
常用英文縮略詞表
第一部分 文獻綜述
    1 與皰疹病毒感染吸附有關(guān)的主要基因及受體
    2 皰疹病毒gC的主要功能
        2.1 gC介導(dǎo)病毒吸附到宿主細(xì)胞
        2.2 gC參與病毒的增殖和釋放
        2.3 gC與病毒毒力有關(guān)
    3 皰疹病毒基因缺失疫苗
        3.1 基因缺失疫苗的定義
        3.2 基因缺失疫苗的構(gòu)建與篩選
        3.3 基因缺失疫苗的研究進展
    4 選題目的及意義
第二部分 試驗研究
    第一章 鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的吸附感染宿主細(xì)胞的特性研究
        1 試驗材料
            1.1 毒株、質(zhì)粒、抗體及鴨胚
            1.2 分子生物學(xué)試劑和耗材
            1.3 常用實驗試劑及配制
                1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒核酸基因組DNA提取用溶液
                1.3.2 SDS-PAGE及western blot常用液體
            1.4 主要儀器
        2 試驗方法
            2.1 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測DPV-△gC-EGFP、DPV-CHv方法的建立
                2.1.1 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR引物設(shè)計
                2.1.2 制備標(biāo)準(zhǔn)品
                2.1.3 構(gòu)建SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線
            2.2 gC對病毒吸附的影響
                2.2.1 病毒吸附能力的測定
                2.2.2 吸附能力的差異對病毒增殖的影響
            2.3 肝素、肝素酶對病毒吸附感染宿主細(xì)胞的影響
            2.4 DPV-gC與HS親和力的測定
                2.4.1 DPV-gB、DPV-gC、DPV-gE原核表達蛋白的制備
                2.4.2 重組表達蛋白與HS親和力試驗
        3 試驗結(jié)果
            3.1 SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
                3.1.1 檢測EGFP基因?qū)崟r熒光定量PCR方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線
                3.1.2 檢測gC基因?qū)崟r熒光定量PCR方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.2 DPV-AgC-EGFP與DPV-CHv的宿主細(xì)胞吸附能力
            3.3 肝素和肝素酶對病毒吸附感染宿主細(xì)胞的影響
            3.4 DPV-gC結(jié)合HS的能力檢測
        4 分析與討論
            4.1 病毒定量的方法
            4.2 鴨瘟病毒gC介導(dǎo)的的吸附感染宿主細(xì)胞的特性
    第二章 鴨瘟病毒gC~-/TK~-雙基因缺失株構(gòu)建及部分生長特性
        1 試驗材料
            1.1 毒株
            1.2 菌株
            1.3 分子生物學(xué)試劑和耗材
            1.4 常用實驗試劑及配制
                1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及病毒核酸基因組DNA提取用溶液
                1.4.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化用溶液
                1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)溶液
            1.5 主要儀器
        2 試驗方法
            2.1 Red重組敲除gC基因
                2.1.1 RCR引物設(shè)計
                2.1.2 同源打靶片段RCR擴增
                2.1.3 RCR產(chǎn)物回收
                2.1.4 含pKD46和DPV CHv-BAC-G感染性克隆DH10B感受態(tài)的制備
                2.1.5 電轉(zhuǎn)化線性打靶片段gC左臂-FRT-kana-FRT-gC右臂
            2.2 拯救重組病毒DPV CHv-BAC-G△gC
                2.2.1 中量提取DPV CHv-BAC-G△gC
                2.2.2 拯救DPV CHv-BAC-G△gC重組病毒
                2.2.3 重組病毒DPV CHv-BAC-G△gC的鑒定
            2.3 DPV CHv-BAC-G△gC的gC回復(fù)突變株構(gòu)建
                2.3.1 gC-kana線性片段的獲取
                2.3.2 第一輪Red重組（將gC-kana重組到CHv-BAC-G△gC基因組）
                2.3.3 第二輪重組（pCP20去除kana抗性）
                2.3.4 RFLP分析
                2.3.5 CHv-BAC-G△gCR回復(fù)突變株的拯救及拯救病毒的鑒定
            2.4 CHv-BAC-G△gC、CHv-BAC-G△gCR的體外生物學(xué)特性初步研究
                2.4.1 空斑試驗
                2.4.2 一步生長曲線
        3 試驗結(jié)果
            3.1 Red重組敲除gC基因
            3.2 DPV CHv-BAC-G△gC的拯救及拯救病毒的鑒定
            3.3 gC回復(fù)突變株DPV CHv-BAC-G△gCR的構(gòu)建
                3.3.1 gC-kana線性片段的獲取
                3.3.2 CHv-BAC-G△gCR回復(fù)突變株第一輪Red重組及鑒定
                3.3.3 CHv-BAC-G△gCR回復(fù)突變株第二輪重組及鑒定
                3.3.4 RFLP分析
            3.4 gC回復(fù)突變株DPV CHv-BAC-GAgCR病毒的拯救及鑒定
            3.5 DPV CHv-BAC-G△gC、DPV CHv-BAC-G△gCR的生物學(xué)特性初步研究
                3.5.1 空斑試驗
                3.5.2 一步生長曲線測定
        4 分析與討論
            4.1 重組病毒的構(gòu)建
            4.2 鴨瘟病毒gC~-/TK~-雙基因缺失株部分生長特性
第三部分 結(jié)論
參考文獻
致謝
附表


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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[3]偽狂犬病gE-/gI-基因缺失突變株及禽流感假病毒的構(gòu)建以及免疫效果的研究[D]. 張松林.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008

碩士論文
[1]牛傳染性鼻氣管炎TK/gE基因缺失重組病毒的研究[D]. 定明.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010
[2]鴨瘟病毒UL27基因主要抗原域蛋白的原核表達、純化、抗體制備及應(yīng)用[D]. 林丹.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009
[3]豬偽狂犬病病毒gC基因的克隆及生物信息學(xué)分析[D]. 王鍵義.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2008



本文編號：3180054