本研究利用數(shù)字化基因表達(dá)譜（Digital Gene Expression Profile, DGEP）分析技術(shù)篩查感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒后差異表達(dá)的抗菌肽（Antimicrobial peptides, AMPs）,并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對其進(jìn)行檢測。將篩查到的AMPs在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá),經(jīng)鎳柱、離子交換柱和透析技術(shù)進(jìn)行純化后,獲得純度達(dá)95%以上的重組蛋白。采用抑菌實(shí)驗(yàn)、MTT法、掃描電鏡、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對重組AMPs的抑菌活性、細(xì)胞毒性和抗炎作用進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：1.利用生物信息學(xué)、DGEP數(shù)據(jù)庫和實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選出15個(gè)具有表達(dá)差異的AMPs；2.根據(jù)畢赤酵母（Pichia pastoris）的偏好性對AMPs的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化并人工合成密碼子優(yōu)化的序列,通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒,采用電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組質(zhì)粒導(dǎo)入Pichia pastoris中,最終建立了能夠表達(dá)CST11、NK-lysin和β-defensin-2三種豬源AMPs的重組畢赤酵母,重組酵母經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后,表達(dá)上清液經(jīng)ProteinPure Ni-NTA介質(zhì)、離子交換... 

【文章來源】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)山西省

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 AMPs的研究進(jìn)展
        1.1 AMPs的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制
        1.2 AMPs的生物學(xué)功能
        1.3 AMPs的生產(chǎn)途徑
    2 Cystatin的研究進(jìn)展
        2.1 Cystatin的結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制
        2.2 Cystatin的生物學(xué)功能
        2.3 Cystatin的體外表達(dá)研究
    3 NK-lysin的研究進(jìn)展
        3.1 NK-lysin及其生物學(xué)活性
        3.2 NK-lysin衍生肽及其生物學(xué)功能
    4 β-defensin-2
        4.1 defensin家族
        4.2 pBD-2的研究進(jìn)展
    5 本研究的目的及研究內(nèi)容
    參考文獻(xiàn)
第二章 基于數(shù)字表達(dá)譜分析技術(shù)篩查PRRS模型豬內(nèi)源性AMPs
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)組織樣品
        1.2 主要儀器與試劑
        1.3 試驗(yàn)方法
    2 試驗(yàn)結(jié)果
        2.1 差異基因的篩選
        2.2 熒光定量PCR結(jié)果
    3 討論
    4 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第三章 豬可溶性cystatin 11的真核表達(dá)及體外活性研究
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 主要儀器
        1.3 所用試劑及其配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 目的基因的獲得
        2.2 表達(dá)質(zhì)粒pwPICZalpha的制備
        2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        2.4 重組酵母的構(gòu)建和鑒定
        2.5 重組CST11的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定
        2.6 重組CST11溶血活性的測定
        2.7 重組CST11活性的測定
        2.8 掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)
        2.9 蛋白酶抑制試驗(yàn)
    3 結(jié)果
        3.1 重組CST11的Western blot鑒定
        3.2 重組CST11的純化
        3.3 重組CST11的抗菌活性
        3.4 重組CST11對細(xì)菌形態(tài)的影響
        3.5 重組CST11的溶血活性
        3.6 重組CST11的蛋白酶抑制活性
    4 討論
    5 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第四章 豬可溶性NK-lysin的真核表達(dá)及體外活性鑒定
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 主要儀器
        1.3 所用試劑及其配制
        1.4 引物序列
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 NK-lysin在畢赤酵母中的表達(dá)
        2.2 重組NK-lysin的純化
        2.3 重組NK-lysin體外活性的測定
    3 結(jié)果
        3.1 重組NK-lysin的Western blot鑒定
        3.2 重組NK-lysin的純化結(jié)果
        3.3 重組NK-lysin的體外活性
    4 討論
    5 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第五章 豬可溶性β-defensin-2的真核表達(dá)及體外活性研究
    1 試驗(yàn)材料
        1.1 質(zhì)粒和菌株
        1.2 主要儀器
        1.3 所用試劑及其配制
        1.4 引物序列
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 β-defensin-2在畢赤酵母中的表達(dá)
        2.2 重組β-defensin-2的純化
        2.3 重組β-defensin-2體外活性的測定
    3 結(jié)果
        3.1 重組β-defensin-2的Western blot鑒定
        3.2 重組β-defensin-2的純化結(jié)果
        3.3 重組β-defensin-2的體外活性
    4 討論
    5 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論
附錄：在讀期間課題相關(guān)科研論著與成果
Abstract
致謝



本文編號：3180208