本試驗主要采用高通量測序,探究miRNA在山羊發(fā)情周期中差異表達變化,并預(yù)測其靶基因,通過GO和KEGG富集分析找出與山羊發(fā)情調(diào)控的相關(guān)通路。本研究將從表觀遺傳上,探究山羊發(fā)情周期中miRNA差異表達的變化,有利于闡述山羊發(fā)情規(guī)律分子機制,將為下一步的分子育種以及選育具有高繁殖力的種群奠定理論基礎(chǔ)。（1）將采集到的安淮山羊卵泡期與黃體期的下丘腦、垂體、卵巢組織進行高通量測序。此次測序所建立的6個文庫中,卵泡期下丘腦（FH）、黃體期下丘腦（LH）、卵泡期垂體（FP）、黃體期垂體（LP）、卵泡期卵巢（FO）、黃體期卵巢（LO）中分別得到12125000、11696869、11319069、11432846、11727490、12209928個原始序列,過濾掉低質(zhì)量的序列得到11788536、11344763、11162888、11016438、11546193、12013471條純凈序列。（2）為得到6個文庫中miRNA表達譜及其在山羊基因組中的具體信息,我們將對6個文庫中的miRNA進行靶基因預(yù)測,并進行相關(guān)生物信息學(xué)分析。與NCBI上山羊基因組進行同源類比,FH、LH、FP、LP、FO... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
英文縮略詞表
文章綜述
    1.“下丘腦-垂體-卵巢軸”研究
        1.1“下丘腦-垂體-卵巢軸”組成與功能
        1.2“下丘腦-垂體-卵巢軸”負(fù)反饋調(diào)控機制研究
        1.3 動物發(fā)情周期過程“下丘腦-垂體-性腺軸”研究
    2 TGF-β 家族在卵泡發(fā)育中的研究進展
        2.1 TGF-β 家族簡介
        2.2 TGF-β 家族與卵泡發(fā)育
    3“下丘腦-垂體-卵巢軸”中與繁殖相關(guān)miRNAs研究
        3.1 miRNAs的起源與作用機制研究
        3.2 miRNA與下丘腦-垂體研究
        3.3 miRNA與動物卵巢的研究
引言
1 材料與方法
    1.1 試驗材料
        1.1.1 試驗動物及材料
        1.1.2 主要儀器設(shè)備
        1.1.3 主要試劑藥品
    1.2 試驗方法與流程
        1.2.1 卵泡期黃體期HPO差異表達miRNA分析
            1.2.1.1 樣本采集
            1.2.1.2 總RNA提取
            1.2.1.3 總RNA質(zhì)量分析
            1.2.1.4 測序文庫的構(gòu)建和測序分析
            1.2.1.5 原始數(shù)據(jù)的過濾
            1.2.1.6 Small RNA文庫的分類注釋
            1.2.1.7 未知miRNA的預(yù)測
            1.2.1.8 已知miRNA與未知miRNA的差異分析
            1.2.1.9 表達模式聚類分析及其靶基因的預(yù)測
            1.2.1.10 GO富集分析和KEGG通路分析miRNA的靶基因
            1.2.1.11 定量驗證高通量測序結(jié)果
        1.2.2 山羊卵巢顆粒細(xì)胞的分離與鑒定
            1.2.2.1 安淮山羊卵巢顆粒細(xì)胞分離
            1.2.2.2 安淮山羊顆粒細(xì)胞的鑒定
        1.2.3 驗證chi-miR-144-3p靶向作用Follistian的試驗
            1.2.3.1 載體的構(gòu)建
        1.2.4 Follistian過表達與干擾載體的構(gòu)建
            1.2.4.1 載體構(gòu)建FST基因CDS的擴增
            1.2.4.2 PCR產(chǎn)物純化
            1.2.4.3 平末端克隆
            1.2.4.5 p Topo-Blunt Simple載體與p LVX-IRES-Neo的雙酶切
            1.2.4.6 重組載體的構(gòu)建
            1.2.4.7 sh RNA2片段的設(shè)計與引物合成
            1.2.4.8 引物退火
            1.2.4.9 酶連及重組載體轉(zhuǎn)化
        1.2.5 慢病毒的包裝以及感染卵巢顆粒細(xì)胞效果的驗證
            1.2.5.1 HEK-293T細(xì)胞的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染以及病毒濃縮
            1.2.5.2 病毒感染原代卵巢顆粒細(xì)胞效果的觀察
2 結(jié)果與分析
    2.1 電泳檢測總RNA質(zhì)量
    2.2 文庫RNA的質(zhì)量分析
    2.3 小RNA文庫片段長短分布
    2.4 公共及特有序列
    2.5 sRNA比對山羊基因組
    2.6 sRNA的分類注釋
    2.7 已知miRNA比對和新miRNA預(yù)測
    2.8 已知miRNA和新miRNA的差異分析
    2.9 已知miRNAs的表達模式的聚類分析
    2.10 差異表達miRNA靶基因的GO分析
    2.11 差異表達miRNA靶基因的KEGG分析
    2.12 定量驗證測序結(jié)果的趨勢
    2.13 山羊卵巢顆粒細(xì)胞的分離驗證
    2.14 驗證卵巢卵泡期黃體期差異表達chi-miR1443p與FST靶向作用
    2.15 過表達載體的構(gòu)建
    2.16 shRNA載體的構(gòu)建
    2.17 感染原代卵巢顆粒細(xì)胞效果鑒定
    2.18 定量驗證過表達與干擾效率
3. 討論
    3.1 山羊繁殖性狀相關(guān)的miRNA挖掘
    3.2 高通測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析
    3.3 山羊卵巢顆粒細(xì)胞分離與鑒定
    3.4 山羊目標(biāo)miRNAs靶基因的驗證
    3.5 FST表達與干擾病毒載體構(gòu)建與慢病毒的包裝
4. 結(jié)論
參考文獻
作者簡介



本文編號：3179885