細(xì)胞核移植技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為動物新品種的培育提供了新的技術(shù)平臺。然而利用上述技術(shù)在轉(zhuǎn)入目的基因的過程中,為了便于篩選,同時也轉(zhuǎn)入了標(biāo)記基因,抗生素抗性基因和熒光標(biāo)記基因是常用的標(biāo)記基因。標(biāo)記基因的應(yīng)用引起了人們對其安全性方面的關(guān)注和擔(dān)憂。而本研究的目的在于應(yīng)用Cre/loxp重組系統(tǒng),實現(xiàn)標(biāo)記基因的安全刪除。本研究首先給帶有K14啟動子的VEGF164基因兩端帶上兩個相同方向的loxp位點,之后與pDsReD2-1載體連接,成功構(gòu)建了表達(dá)載體pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP。之后用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞,篩選出純度較高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆。獲得的細(xì)胞克隆一部分用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆絨山羊胚胎,經(jīng)胚胎移植后獲得了轉(zhuǎn)基因的絨山羊,今后可以利用該轉(zhuǎn)基因絨山羊的體細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記基因的刪除研究。另一部分用帶有信號肽片段的重組Cre酶即HTNC酶處理,用以檢測不同的處理時間對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞標(biāo)記基因刪除效果的影響。收集不同處理時間的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,并通過實時熒光定量PCR檢測標(biāo)記基因的去除效果,結(jié)果顯示標(biāo)記基因被部分去除,且最佳處理時間為3小時。本研究結(jié)果不但可以為今后核移植生產(chǎn)無標(biāo)記基... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    一、標(biāo)記基因刪除的方法
    二、Cre/loxp重組系統(tǒng)的分子機制
    三、Cre/loxp系統(tǒng)的應(yīng)用
    參考文獻(xiàn)
第二部分 實驗研究
    第一章 表達(dá)載體pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP的構(gòu)建
        1 材料
            1.1 載體與菌種
            1.2 試劑與耗材
        2 方法
            2.1 K14-VEGF-LOXP序列的克隆
            2.2 表達(dá)載體pDsReD2-1-K14-VEGF-LOXP的構(gòu)建
            2.3 表達(dá)載體的PCR和酶切鑒定
            2.4 表達(dá)載體的線性化
        3 結(jié)果
            3.1 K14-VEGF-LOXP序列克隆與分析
            3.2 表達(dá)載體的鑒定
        4 討論
    第二章 絨山羊轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立及標(biāo)記基因的刪除
        1 材料
            1.1 實驗儀器
            1.2 活體實驗材料
            1.3 菌液
            1.4 試劑耗材
            1.5 溶液配制
        2 方法
            2.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞分離與培養(yǎng)
            2.2 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的傳代及凍存
            2.3 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的解凍及復(fù)蘇
            2.4 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的性別鑒定
            2.5 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞生長曲線的測定
            2.6 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選
            2.7 轉(zhuǎn)基因絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的鑒定
            2.8 轉(zhuǎn)基因絨山羊成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因的刪除
            2.9 熒光定量PCR檢測標(biāo)記基因的刪除效果
        3 結(jié)果
            3.1 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
            3.2 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的性別鑒定
            3.3 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞生長曲線的繪制
            3.4 絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
            3.5 轉(zhuǎn)表達(dá)載體絨山羊成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因鑒定
            3.6 轉(zhuǎn)基因絨山羊成纖維細(xì)胞標(biāo)記基因的刪除
            3.7 熒光定量PCR檢測標(biāo)記基因的刪除效果
        4 討論
    第三章 轉(zhuǎn)基因胚胎的制備與轉(zhuǎn)基因絨山羊的生產(chǎn)
        1 材料
            1.1 實驗儀器
            1.2 實驗材料
            1.3 試劑耗材
            1.4 溶液配制
        2 方法
            2.1 卵母細(xì)胞體外成熟
            2.2 轉(zhuǎn)基因絨山羊克隆胚胎的制備及發(fā)育
            2.3 受體母羊的準(zhǔn)備
            2.4 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的移植及產(chǎn)羔
            2.5 轉(zhuǎn)基因絨山羊的鑒定
        3 結(jié)果
            3.1 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的發(fā)育
            3.2 轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的移植及產(chǎn)羔
            3.3 轉(zhuǎn)基因絨山羊的鑒定
            3.4 轉(zhuǎn)基因絨山羊的解剖
        4 討論
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
致謝
附錄1
碩士期間發(fā)表論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]遼寧絨山羊毛囊VEGF表達(dá)及MVD的年周期變化[J]. 姚紀(jì)元,陳洋,李景玉,常青,姜懷志.  中國畜牧雜志. 2013(15)
[2]胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)分離方法對豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育潛力的影響[J]. 黃雅瓊,石德順,陳旭健,李家洲,曾詩媛,謝秋季,趙仕花,阮桂文.  家畜生態(tài)學(xué)報. 2013(06)
[3]遼寧絨山羊皮膚毛囊VEGF基因表達(dá)的RT-PCR檢測[J]. 姚紀(jì)元,李玉梅,徐海錄,楊金生,姜懷志.  中國獸醫(yī)學(xué)報. 2013(03)
[4]胚胎移植方法和受體母豬因素對克隆豬生產(chǎn)效率的影響[J]. 衛(wèi)恒習(xí),李秋艷,高鳳磊,李燕,張守全,李寧.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(15)
[5]不同方法處理供核細(xì)胞對細(xì)胞周期和重構(gòu)胚發(fā)育的影響[J]. 蔡琳琳,阮井玲,王娟,曲立娟,李華,黃英.  生命科學(xué)研究. 2012(02)
[6]毛囊的周期性變化和分子調(diào)控及其在絨山羊上的研究進(jìn)展[J]. 劉志紅,任立明,郭英,胡曉湘,崔文濤,李寧,尹俊,李金泉.  中國畜牧獸醫(yī). 2009(04)
[7]豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及核移植后重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的研究[J]. 王振坤,田江天,李秋明,武美玲,孔慶然,鄭重,于學(xué)武,雷蕾,劉忠華.  分子細(xì)胞生物學(xué)報. 2008(04)
[8]Cre/loxp位點特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用[J]. 邱淑萍,陳在杰,王鋒.  福建農(nóng)業(yè)學(xué)報. 2008(02)
[9]Cre/Loxp系統(tǒng)的應(yīng)用及進(jìn)展[J]. 任榮榮,王英偉.  廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2008(02)
[10]內(nèi)蒙古罕山白絨山羊毛囊生長規(guī)律的研究[J]. 金鳳,李金泉,劉東軍,烏云格日樂,韓強.  中國草食動物. 2008(01)

博士論文
[1]阿爾巴斯白絨山羊與綿羊胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究[D]. 靳木子.內(nèi)蒙古大學(xué) 2013

碩士論文
[1]骨骼肌特異表達(dá)卵泡抑制素基因轉(zhuǎn)基因綿羊研究[D]. 王瑋.內(nèi)蒙古大學(xué) 2011



本文編號：3174493