發(fā)布時(shí)間：2021-04-28 06:21

　　豬博卡病毒（Porcine bocavirus,PBoV）屬于細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒亞科、博卡病毒屬。該病毒是引起豬群腹瀉、呼吸系統(tǒng)疾病以及斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的重要病原。該病毒自2009年被檢出以后,已相繼在世界各國報(bào)道。近年來,PBoV在我國的感染率日益升高,且常與其他病原混合感染,增加了疫病防控的難度。PBoV分不同的基因型,并且各基因型毒株在豬群中流行情況不一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此,了解PBoV河北地區(qū)流行毒株的基因組結(jié)構(gòu)、基因型特征,并建立相應(yīng)的檢測方法對疾病的流行病學(xué)調(diào)查、準(zhǔn)確診斷、預(yù)防及動(dòng)態(tài)監(jiān)控具有重大意義。本研究從河北省一嚴(yán)重腹瀉病發(fā)病豬場檢測到PBoV,將其命名為PBoV/CH/HB/HD/2017株,并對該病毒展開了一系列研究:（1）為了解PBoV/CH/HB/HD/2017株的基因組結(jié)構(gòu)及特點(diǎn),本研究對該毒株進(jìn)行了全基因組序列擴(kuò)增,并分別進(jìn)行了同源性分析及進(jìn)化樹分析。研究結(jié)果表明,PBoV/CH/HB/HD/2017株與25條參考株之間的核苷酸同源性為40.5%–99.4%,并且與中國毒株Bocavirus pig/SX/China/2... 

【文章來源】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)河北省

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 豬博卡病毒概述
        1.1.1 豬博卡病毒形態(tài)特性及基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.2 豬博卡病毒的分型研究
        1.1.3 豬博卡病毒在國內(nèi)外的流行病學(xué)研究
        1.1.4 豬博卡病毒的培養(yǎng)特性
        1.1.5 豬博卡病毒發(fā)病特點(diǎn)及致病機(jī)制分析
    1.2 豬博卡病毒實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)
        1.2.1 普通PCR診斷技術(shù)
        1.2.2 熒光定量PCR診斷技術(shù)
        1.2.3 間接免疫熒光診斷技術(shù)
        1.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增診斷技術(shù)
        1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)診斷技術(shù)
        1.2.6 其他診斷技術(shù)
    1.3 研究的目的及意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 陽性材料、血清樣本及組織樣本
        2.1.2 試驗(yàn)所用試劑
        2.1.3 試驗(yàn)所用溶液
        2.1.4 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 豬博卡病毒全基因組序列擴(kuò)增及分析
        2.2.2 豬博卡病毒NP1 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP1 的蛋白表達(dá)、純化及鑒定
        2.2.4 基于pET-NP1 重組蛋白的豬博卡病毒間接ELISA診斷方法建立
        2.2.5 豬博卡病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立
        2.2.6 豬博卡病毒和豬圓環(huán)2 型病毒雙重?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立
3 結(jié)果
    3.1 豬博卡病毒全基因序列擴(kuò)增及分析
        3.1.1 豬博卡病毒PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.1.2 豬博卡病毒全基因組序列的拼接及結(jié)構(gòu)分析
        3.1.3 豬博卡病毒全基因組序列分析
    3.2 豬博卡病毒NP1 重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果
        3.2.1 豬博卡病毒NP1 表達(dá)基因的PCR擴(kuò)增
        3.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定鑒定結(jié)果
    3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP1 的蛋白表達(dá)、純化及鑒定結(jié)果
        3.3.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NP1 的蛋白表達(dá)結(jié)果
        3.3.2 重組pET-NP1 蛋白純化結(jié)果
        3.3.3 重組pET-NP1 蛋白Western-blotting鑒定
    3.4 豬博卡病毒重組pET-NP1 蛋白間接ELISA診斷方法建立
        3.4.1 間接ELISA最佳抗原包被濃度及最優(yōu)血清稀釋倍數(shù)
        3.4.2 最優(yōu)封閉液的確定
        3.4.3 最適包被條件的確定
        3.4.4 最佳酶標(biāo)抗體濃度的確定
        3.4.5 ELISA臨界值的確定
        3.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.4.7 特異性試驗(yàn)
        3.4.8 臨床樣品的檢測
    3.5 豬博卡病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立
        3.5.1 PBoV和 PEDV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
        3.5.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.5.4 特異性試驗(yàn)
        3.5.5 敏感性試驗(yàn)
        3.5.6 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.5.7 臨床樣品檢測
    3.6 豬博卡病毒和豬圓環(huán)病毒2 型雙重?zé)晒舛縋CR方法的建立
        3.5.1 PBoV和 PCV2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
        3.5.2 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化
        3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.5.4 特異性試驗(yàn)
        3.5.5 敏感性試驗(yàn)
        3.5.6 重復(fù)性試驗(yàn)
        3.5.7 臨床樣品檢測
4 討論
    4.1 豬博卡病毒全基因組序列擴(kuò)增
    4.2 豬博卡病毒重組pET-NP1 蛋白間接ELISA診斷方法建立
    4.3 豬博卡病毒和豬流行性腹瀉病毒熒光定量PCR檢測方法的建立
    4.4 豬博卡病毒和豬圓環(huán)病毒2 型熒光定量PCR檢測方法的建立
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡介
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]豬流行性腹瀉病毒和豬博卡病毒3/4/5型雙重PCR檢測方法的建立[J]. 韓昊瑩,張鴻鑫,徐朋麗,喬涵,張宇,楊興武,陳紅英.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2018(03)
[2]豬博卡病毒病原學(xué)和檢測方法研究進(jìn)展[J]. 汪洋,李玲,李真,李峰.  動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展. 2017(04)
[3]豬博卡病毒PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 周宇,李春萍,朱事康,宋斯偉,徐鵬,陳燕忠,欒維民.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(09)
[4]豬博卡病毒1型/2型PCR檢測方法的建立[J]. 付朋飛,李夢奇,喬涵,楊興武,張宇,徐朋麗,韓昊瑩,張鴻鑫,陳紅英.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(07)
[5]豬博卡病毒3/4/5型PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 付朋飛,楊興武,喬涵,潘鑫龍,郭曉慶,張宇,郭珍珍,陳紅英.  中國獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(06)
[6]四川規(guī)�；i場腹瀉仔豬病毒性腹瀉病原的分子檢測[J]. 蔡雨函,周遠(yuǎn)成,艾能,李碧,潘夢.  豬業(yè)科學(xué). 2016(02)
[7]豬博卡病毒病原學(xué)及其檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 李達(dá),韋國渠,湯德元,李春燕,曾智勇,郝飛,劉建,王洪光.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2015(11)
[8]豬博卡病毒NP1基因特異性的PCR方法建立及應(yīng)用[J]. 葉星宇,聶奎,聶福平.  西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2015(05)
[9]豬博卡病毒NP1基因的克隆及其生物信息學(xué)分析[J]. 鄭英帥,左奕,柴瑞影,戚妍,李雅楠,袁萬哲,孫繼國.  河南農(nóng)業(yè)科學(xué). 2015(03)
[10]豬博卡病毒5型SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 陳鵬強(qiáng),胡崇偉,陳秋勇,林群群,修金生.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2015(02)

博士論文
[1]豬博卡病毒類病毒顆粒的表達(dá)以及在流行病學(xué)方面的應(yīng)用[D]. 張文靜.山東大學(xué) 2016

碩士論文
[1]豬丁型冠狀病毒檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D]. 羅尚星.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]豬丁型冠狀病毒HB-BD株分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D]. 劉寶京.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[3]豬博卡病毒間接ELISA方法的建立及與PCV2共感染對細(xì)胞的影響[D]. 張晶.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[4]豬博卡病毒VP2蛋白的原核表達(dá)與間接ELISA檢測方法的建立及應(yīng)用[D]. 蔡高峰.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[5]豬博卡病毒間接ELISA診斷方法的建立[D]. 鄭英帥.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



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