豬痘（Swinepox）是由豬痘病毒（Swinepox Virus,SWPV）引起豬的一種以皮膚形成痘疹和結(jié)痂為特征的傳染病,絕大部分感染豬能自行康復,對養(yǎng)豬業(yè)造成的損失極小。SWPV具有基因組大（146kb）、含有多個復制非必需區(qū)、可以插入大片段的外源基因、嚴格的宿主特異性等特點,使其特別適合作為活疫苗載體。為建立重組豬痘病毒疫苗載體技術(shù)平臺,本研究從江西地區(qū)分離到一株豬痘病毒,以該分離毒株為親本病毒,采用同源重組技術(shù)構(gòu)建表達豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2,PCV2）衣殼蛋白的重組豬痘病毒。1.豬痘病毒的分離與鑒定從江西省某豬場疑似豬痘的育肥豬皮膚痘痂中進行病毒分離,分離到一株豬痘病毒,命名為JX-20G株。參考GenBank登錄的SWPV（AF410153.1）,設(shè)計 SPV027-029、SPV043-044、SPV063、SPV071 4 對引物,以 JX-20G株DNA作為模板,分別進行PCR擴增,擴增到1688bp、1560bp、960bp、975bp的特異性目的條帶,通過序列分析,獲得了 SPV027、SPV028、SPV043、SPV... 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學江西省

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮寫詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 豬痘病毒研究進展
        1.1.1 豬痘病毒的形態(tài)學及理化特性
        1.1.2 豬痘病毒的理化特性
        1.1.3 豬痘的發(fā)病概況
        1.1.4 豬痘病毒分子生物學特性
        1.1.5 豬痘病毒作為載體的研究進展
    1.2 豬圓環(huán)病毒2型研究進展
        1.2.1 豬圓環(huán)病毒2型病原學
        1.2.2 豬圓環(huán)病毒2型基因結(jié)構(gòu)與功能
    1.3 豬圓環(huán)病毒2型疫苗研究進展
        1.3.1 滅活苗
        1.3.2 弱毒疫苗
        1.3.3 基因工程苗
第二章 豬痘病毒JX-20G株的分離與鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 病料及細胞株
        2.1.2 實驗試劑及配制
        2.1.3 實驗器材
        2.1.4 引物設(shè)計
    2.2 實驗方法
        2.2.1 豬痘病毒的分離
        2.2.2 豬痘病毒分離毒株的鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 豬痘病毒的分離
        2.3.2 豬痘病毒的鑒定
        2.3.3 豬痘病毒基因序列及推導的氨基酸序列同源性分析
        2.3.4 豬痘病毒基因與其它痘病毒屬基因的同源基因進化關(guān)系
        2.3.5 病毒粒子的電鏡觀察
    2.4 討論
        2.4.1 豬痘病毒的PK15細胞培養(yǎng)特性
        2.4.2 豬痘病毒JX-20G株序列分析
        2.4.3 豬痘病毒JX-20G株病毒粒子的電鏡觀察
    2.5 小結(jié)
第三章 豬圓環(huán)病毒2型全基因組克隆及序列分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株和毒株
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 試劑配制
        3.1.4 主要儀器設(shè)備
        3.1.5 引物設(shè)計
    3.2 實驗方法
        3.2.1 病毒DNA的提取
        3.2.2 PCR擴增
        3.2.3 PCR產(chǎn)物純化
        3.2.4 連接
        3.2.5 轉(zhuǎn)化
        3.2.6 PCR鑒定
        3.2.7 分離毒株的同源性及進化分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 PCV2型全基因組的PCR結(jié)果
        3.3.2 PCV2全基因及部分主要基因序列同源性分析
        3.3.3 PCV2 ORF2基因推導的氨基酸序列分析
        3.3.4 PCV2及PCV2 ORF2基因遺傳進化樹分析
    3.4 討論
第四章 表達PCV2衣殼蛋白重組豬痘病毒的構(gòu)建
    4.1 實驗材料
        4.1.1 細胞和病毒
        4.1.2 主要試劑及配制
        4.1.3 主要儀器設(shè)備
        4.1.4 P11、P7.5和P28啟動子序列
        4.1.5 引物設(shè)計
    4.2 pSWE 1-28C、pSWE11-7.5C載體構(gòu)建實驗方法
        4.2.1 SWPV的培養(yǎng)
        4.2.2 病毒DNA的提取
        4.2.3 TK1、TK2和P11-egfp基因的PCR擴增
        4.2.4 P7.5啟動子、P7.5-Cap和P28-Cap片段的PCR擴增
        4.2.5 轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
        4.2.6 pSWE11-28C載體的構(gòu)建
        4.2.7 pSWE11-7.5C載體的構(gòu)建
    4.3 pSW-E11-28C、pSW-E11-7.5C重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及重組病毒純化
        4.3.1 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的提取及濃度測定
        4.3.2 轉(zhuǎn)染過程
        4.3.3 重組病毒的純化
        4.3.4 重組病毒的PCR鑒定
        4.3.5 重組病毒的Western blotting分析
        4.3.6 重組病毒超薄切片觀察
        4.3.7 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性實驗
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 重組臂和egfp基因的擴增結(jié)果
        4.4.2 P7.5-Cap、P28-Cap和P7.5啟動子基因的PCR結(jié)果
        4.4.3 轉(zhuǎn)移載體pSWE11的酶切鑒定
        4.4.4 重組載體pSWE11-28C和pSWE11-7.5C的酶切驗證
        4.4.5 轉(zhuǎn)染
        4.4.6 重組病毒的純化
        4.4.7 重組病毒的PCR鑒定
        4.4.8 重組病毒的Western blotting分析
        4.4.9 重組病毒超薄切片觀察
        4.4.10 重組病毒的遺傳穩(wěn)定性實驗
    4.5 討論
        4.5.1 豬痘病毒TK基因作為外源片段插入位點
        4.5.2 篩選基因的選擇
        4.5.3 表達Cap蛋白重組豬痘病毒作為活載體疫苗
    4.6 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻
附件
致謝



本文編號：3156529