口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染的動(dòng)物疫病。疫苗免疫是口蹄疫防控的主要措施。然而,常規(guī)疫苗常出現(xiàn)疫苗保護(hù)率不高、弱毒苗毒力返祖等現(xiàn)象而造成口蹄疫疾病的爆發(fā)。因此深入研究口蹄疫病毒的致病機(jī)制并制備保護(hù)率更佳、免疫效果更穩(wěn)定的疫苗對(duì)口蹄疫的防控至關(guān)重要。本研究借助正交系統(tǒng)在體外拯救口蹄疫病毒。首先構(gòu)建pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突變體琥珀抑制真核表達(dá)質(zhì)粒和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達(dá)質(zhì)粒,并共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,通過(guò)G418和嘌呤霉素篩選、Western-blot鑒定,獲得穩(wěn)定表達(dá)正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的細(xì)胞系,并鑒定該細(xì)胞系的穩(wěn)定性。構(gòu)建口蹄疫野生型質(zhì)粒,分別構(gòu)建表達(dá)VP1、VP2、VP3和3D蛋白的野生型質(zhì)粒,并在不同位點(diǎn)引入TAG終止密碼子獲得VP1、VP2、VP3和3D蛋白的突變質(zhì)粒,將野生型質(zhì)粒和突變質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)正交氨酰tRNA合成酶/tRNA細(xì)胞系中,Western-blot鑒定,篩選出能夠在穩(wěn)定表達(dá)正交氨酰tRNA合成酶/tRNA細(xì)胞系中表達(dá)目的蛋白的突變質(zhì)粒... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 口蹄疫病毒
        1.1.1 5′端非編碼區(qū)
        1.1.2 開(kāi)放閱讀框
        1.1.3 3′端非編碼區(qū)
    1.2 正交系統(tǒng)
        1.2.1 遺傳密碼擴(kuò)充技術(shù)
        1.2.2 正交系統(tǒng)的定義和應(yīng)用范圍
        1.2.3 琥珀正交系統(tǒng)
    1.3 體外拯救口蹄疫病毒
        1.3.1 反向遺傳操作技術(shù)拯救口蹄疫病毒
        1.3.2 運(yùn)用正交系統(tǒng)拯救口蹄疫病毒
第二章 pCMV-EGFP野生型重組質(zhì)粒和pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突變體琥珀抑制真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 pCMV-EGFP Wild Type野生型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2.2 pCMV-EGFP-Tyr40TAG琥珀抑制真核表達(dá)重組質(zhì)粒的克隆及構(gòu)建
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 pCMV-EGFP-WT野生型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.3.2 pEGFP-Tyr40TAG突變質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
    2.4 結(jié)論與討論
第三章 穩(wěn)定表達(dá)正交氨酰t RNA合成酶/tRNA的細(xì)胞系的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.2 穩(wěn)定表達(dá)正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的細(xì)胞系的構(gòu)建
        3.2.3 單克隆細(xì)胞系的鑒定
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.3.2 正交系統(tǒng)的鑒定結(jié)果
    3.4 結(jié)論與討論
第四章 口蹄疫病毒的體外拯救
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 pFMDV-O/BY/CHA/2010 野生型重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.2 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 FMDV-O-WT野生型病毒和FMDV-O-TAG突變病毒的體外拯救
        4.2.4 基因工程毒的鑒定
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 pFMDV-O-WT野生型質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.2 TAG突變位點(diǎn)的篩選結(jié)果
        4.3.3 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突變質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.4 RT-PCR擴(kuò)增的結(jié)果
        4.3.5 測(cè)序結(jié)果
        4.3.6 細(xì)胞病變結(jié)果
    4.4 結(jié)論與討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄拯救Asia1型口蹄疫病毒[J]. 李平花,白興文,盧曾軍,孫普,郭建宏,李冬,曹偉軍,陳應(yīng)理,劉湘濤,殷宏,劉在新.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2009(02)



本文編號(hào)：3153991