口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease,FMD）是由口蹄疫病毒引起的急性、熱性、高度接觸性傳染的動物疫病。疫苗免疫是口蹄疫防控的主要措施。然而,常規(guī)疫苗常出現(xiàn)疫苗保護率不高、弱毒苗毒力返祖等現(xiàn)象而造成口蹄疫疾病的爆發(fā)。因此深入研究口蹄疫病毒的致病機制并制備保護率更佳、免疫效果更穩(wěn)定的疫苗對口蹄疫的防控至關重要。本研究借助正交系統(tǒng)在體外拯救口蹄疫病毒。首先構建pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突變體琥珀抑制真核表達質(zhì)粒和正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達質(zhì)粒,并共轉染BHK-21細胞,通過G418和嘌呤霉素篩選、Western-blot鑒定,獲得穩(wěn)定表達正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的細胞系,并鑒定該細胞系的穩(wěn)定性。構建口蹄疫野生型質(zhì)粒,分別構建表達VP1、VP2、VP3和3D蛋白的野生型質(zhì)粒,并在不同位點引入TAG終止密碼子獲得VP1、VP2、VP3和3D蛋白的突變質(zhì)粒,將野生型質(zhì)粒和突變質(zhì)粒分別轉染穩(wěn)定表達正交氨酰tRNA合成酶/tRNA細胞系中,Western-blot鑒定,篩選出能夠在穩(wěn)定表達正交氨酰tRNA合成酶/tRNA細胞系中表達目的蛋白的突變質(zhì)粒... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：60 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 口蹄疫病毒
        1.1.1 5′端非編碼區(qū)
        1.1.2 開放閱讀框
        1.1.3 3′端非編碼區(qū)
    1.2 正交系統(tǒng)
        1.2.1 遺傳密碼擴充技術
        1.2.2 正交系統(tǒng)的定義和應用范圍
        1.2.3 琥珀正交系統(tǒng)
    1.3 體外拯救口蹄疫病毒
        1.3.1 反向遺傳操作技術拯救口蹄疫病毒
        1.3.2 運用正交系統(tǒng)拯救口蹄疫病毒
第二章 pCMV-EGFP野生型重組質(zhì)粒和pCMV-EGFP-Tyr40-TAG突變體琥珀抑制真核表達質(zhì)粒的構建
    2.1 材料
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 實驗儀器
        2.1.4 常用試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 pCMV-EGFP Wild Type野生型重組質(zhì)粒的構建
        2.2.2 pCMV-EGFP-Tyr40TAG琥珀抑制真核表達重組質(zhì)粒的克隆及構建
    2.3 結果
        2.3.1 pCMV-EGFP-WT野生型重組質(zhì)粒的構建
        2.3.2 pEGFP-Tyr40TAG突變質(zhì)粒的鑒定結果
    2.4 結論與討論
第三章 穩(wěn)定表達正交氨酰t RNA合成酶/tRNA的細胞系的構建
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達質(zhì)粒的構建
        3.2.2 穩(wěn)定表達正交氨酰tRNA合成酶/tRNA的細胞系的構建
        3.2.3 單克隆細胞系的鑒定
    3.3 實驗結果
        3.3.1 正交氨酰tRNA合成酶/tRNA真核表達質(zhì)粒的構建
        3.3.2 正交系統(tǒng)的鑒定結果
    3.4 結論與討論
第四章 口蹄疫病毒的體外拯救
    4.1 實驗材料
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 pFMDV-O/BY/CHA/2010 野生型重組質(zhì)粒的構建
        4.2.2 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突變質(zhì)粒的構建
        4.2.3 FMDV-O-WT野生型病毒和FMDV-O-TAG突變病毒的體外拯救
        4.2.4 基因工程毒的鑒定
    4.3 實驗結果
        4.3.1 pFMDV-O-WT野生型質(zhì)粒的構建
        4.3.2 TAG突變位點的篩選結果
        4.3.3 pFMDV-O/BY/CHA/2010-TAG突變質(zhì)粒的構建
        4.3.4 RT-PCR擴增的結果
        4.3.5 測序結果
        4.3.6 細胞病變結果
    4.4 結論與討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]細胞內(nèi)轉錄拯救Asia1型口蹄疫病毒[J]. 李平花,白興文,盧曾軍,孫普,郭建宏,李冬,曹偉軍,陳應理,劉湘濤,殷宏,劉在新.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2009(02)



本文編號：3153991