豬δ冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCo V）是一種新興冠狀病毒,可引發(fā)仔豬的嘔吐、腹瀉、脫水,甚至死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。PDCo V主要編碼的4個結(jié)構(gòu)蛋白是:纖突蛋白（spike,S）、核衣殼蛋白（nucleocapsid,N）、膜糖蛋白（membrane,M）、小膜蛋白（envelope,E）。其中,N蛋白在病毒RNA復(fù)制和產(chǎn)生過程中起重要作用,表達(dá)量大、保守性強,常作為其他冠狀病毒檢測病毒抗體的診斷抗原。決定抗原特異性的分子基礎(chǔ)是抗原表位,通過對其進(jìn)行研究,有利于進(jìn)一步設(shè)計兼具有免疫活性和中和活性的多肽、新型診斷試劑和新型疫苗分子。鑒于此,本研究通過制備PDCo V N蛋白單克隆抗體并對抗原表位進(jìn)行篩選與鑒定,為PDCo V診斷方法和新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。為了獲取PDCo V N基因重組蛋白,本試驗分別構(gòu)建了PDCo V NH毒株的N基因的p ET-32a和p GEX-6p-1原核表達(dá)載體,并分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中,利用濃度為1 m M的IPTG對重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),進(jìn)一步對表達(dá)的PDCo V重組N蛋白進(jìn)行純化與鑒... 

【文章來源】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)黑龍江省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 PDCoV概述
        1.1.1 病原學(xué)
        1.1.2 基因組結(jié)構(gòu)
        1.1.3 結(jié)構(gòu)蛋白及功能
        1.1.4 PDCoV的流行病學(xué)
        1.1.5 冠狀病毒跨種屬傳播的機制
        1.1.6 PDCoV的病毒分離及體外培養(yǎng)特性
        1.1.7 PDCoV的致病性及臨床癥狀
        1.1.8 PDCoV的診斷與檢測技術(shù)
        1.1.9 疾病的防治
    1.2 研究目的與意義
2 豬δ冠狀病毒重組N蛋白的制備與抗原性檢測
    2.1 材料
        2.1.1 主要試劑、毒株及菌種
        2.1.2 主要儀器設(shè)備
    2.2 方法
        2.2.1 RNA提取
        2.2.2 采用RT-PCR方法將目的基因片段擴(kuò)增
        2.2.3 PCR產(chǎn)物的膠回收
        2.2.4 PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體的雙酶切
        2.2.5 產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
        2.2.6 鑒定重組質(zhì)粒并表達(dá)蛋白
        2.2.7 PDCoVN蛋白的純化
        2.2.8 PDCoV重組N蛋白的抗原性分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 PDCoVN基因的擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果
        2.3.3 表達(dá)重組蛋白并純化、鑒定
        2.3.4 重組N蛋白的Westernblot分析
    2.4 討論
3 豬δ冠狀病毒N蛋白單克隆抗體制備及鑒定
    3.1 材料
        3.1.1 主要試劑、細(xì)胞及實驗動物
        3.1.2 主要實驗儀器及設(shè)備
    3.2 方法
        3.2.1 單克隆抗體的制備
        3.2.2 單克隆抗體的鑒定
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 間接ELISA檢測方法的建立
        3.3.2 雜交瘤細(xì)胞株的建立
        3.3.3 單克隆抗體的效價測定
        3.3.4 抗體亞類的鑒定
        3.3.5 單抗免疫活性及特異性鑒定結(jié)果
        3.3.6 IFA試驗結(jié)果
    3.4 討論
4 豬δ冠狀病毒N蛋白抗原表位的鑒定
    4.1 材料
        4.1.1 主要試劑、毒株及菌種
        4.1.2 主要實驗儀器及設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 N蛋白抗原表位的初步鑒定
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 N蛋白分段擴(kuò)增、克隆與表達(dá)
        4.3.2 1E10株針對抗原表位的初步鑒定
    4.4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[4]豬流行性腹瀉病毒核衣殼蛋白亞細(xì)胞定位信號的鑒定[D]. 石達(dá).中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[5]應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選抗豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的模擬表位[D]. 王萬利.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2009
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本文編號：3152656