發(fā)布時間：2021-04-21 21:33

　　馬立克氏病病毒（Marek’s Disease Virus, MDV） GX0101株是我們實驗室在2001年從廣西某雞場中分離到一株帶有禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）長末端重復序列（LTR）的1型MDV GX0101，其致病型為超強毒。將該毒株構(gòu)建成細菌人工染色體（BAC）克隆，并在此傳染性克隆的基礎(chǔ)上進行了一系列的研究。其中敲除了GX0101兩個致腫瘤基因Meq，構(gòu)建了Meq缺失株GX0101ΔMeq，通過動物實驗證明該突變株不僅失去了雞群的致病性和免疫抑制，而且還可以對雞群起到很好的保護性免疫作用，其保護效果要超過CVI988疫苗。本研究在GX0101ΔMeq的基礎(chǔ)上，將該突變株作為載體表達H9N2禽流感病毒的HA基因，構(gòu)建了不同的重組病毒并對這些重組病毒進行了體外和體內(nèi)的研究。1抗H9N2-HA鼠多克隆抗體的制備及H9N2-HA真核表達載體的構(gòu)建本研究中構(gòu)建了9株以GX0101ΔMeq為載體表達H9N2-HA的重組病毒。為了驗證重組病毒中HA基因在體外的表達，首先制備了H9N2禽流感HA的鼠多克隆抗體，用于后續(xù)研究中HA基因在重組MDV表達的檢測。然后又構(gòu)建表達H9N2-H... 

【文章來源】：山東農(nóng)業(yè)大學山東省

【文章頁數(shù)】：141 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
符號說明
中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 馬立克氏�。∕D）的研究進展
        1.1.1 病原學
        1.1.2 流行病學
        1.1.3 感染機制及病理變化
        1.1.4 診斷技術(shù)
        1.1.5 致病性及疾病防制策略
    1.2 MDV 分子生物學研究進展
        1.2.1 MDV 基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2 MDV 結(jié)構(gòu)蛋白及相關(guān)基因
    1.3 禽反轉(zhuǎn)錄病毒與 MDV 基因重組的研究進展
        1.3.1 病毒的變異
        1.3.2 MDV 與 REV 間基因重組
        1.3.3 MDV 與 ALV 間基因重組
        1.3.4 REV 與 MDV 基因重組的機制
        1.3.5 不同病毒間遺傳重組流行病學意義
    1.4 DNA 片段克隆的載體系統(tǒng)
        1.4.1 質(zhì)粒
        1.4.2 粘粒
        1.4.3 BAC 的優(yōu)勢及其發(fā)展
    1.5 MD 的防制
        1.5.1 免疫機理
        1.5.2 疫苗研究進展
        1.5.3 目前 MDV 疫苗的種類
    1.6 禽流感研究進展
        1.6.1 病毒病原學
        1.6.2 禽流感的流行病學
        1.6.3 禽流感的傳播方式
    1.7 H9N2 亞型禽流感的防制
        1.7.1 全病毒滅活疫苗
        1.7.2 亞單位疫苗
        1.7.3 DNA 疫苗
        1.7.4 表位疫苗
        1.7.5 重組活載體疫苗
    1.8 本研究的目的及意義
2 材料和方法
    2.1 主要實驗耗材和儀器
        2.1.1 分子克隆相關(guān)試劑
        2.1.2 常規(guī)細胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
        2.1.3 其他主要試劑
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 相關(guān)菌種、病毒株及載體
    2.2 抗H9N2-HA鼠多克隆抗體的制備及H9N2-HA真核表達載體的構(gòu)建
        2.2.1 H9N2-HA 高免血清的制備
        2.2.2 HA 真核表達載體的構(gòu)建
    2.3 一株表達 H9N2-HA 基因的重組 rGX-CMV-HA 的構(gòu)建
        2.3.1 原理
        2.3.2 含有 HA 表達盒的外源基因與 GX0101ΔMeq 的重組
        2.3.3 利用 Flp/FRT 重組系統(tǒng)敲出 kanr抗性篩選基因
        2.3.4 大量提取重組質(zhì)粒
        2.3.5 重組病毒的拯救
        2.3.6 rGX-CMV-HA 的生物學活性檢測
    2.4 重組 MDV 中不同啟動子轉(zhuǎn)錄 H9N2-HA 基因的活性比較
        2.4.1 引物設(shè)計
        2.4.2 不同啟動子的克隆測序
        2.4.3 不同啟動子轉(zhuǎn)錄 HA 基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.4.4 不同 HA 基因真核表達質(zhì)粒的驗證
        2.4.5 kanr基因和 HA 基因共表達載體的構(gòu)建
        2.4.6 包含 kanr抗性基因和 HA 基因表達盒外源插入片段的擴增
        2.4.7 HA 表達盒與 GX0101 的重組
        2.4.8 重組菌內(nèi) kanr基因表達盒的敲除
        2.4.9 重組病毒的拯救
        2.4.10 重組病毒的驗證
        2.4.11 重組病毒純度檢測
        2.4.12 不同重組病毒體外增殖速率的比較
        2.4.13 重組病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比較
        2.4.14 熒光定量
        2.4.15 重組病毒在體內(nèi)的復制
        2.4.16 重組病毒誘導產(chǎn)生抗體的檢測
        2.4.17 攻毒保護實驗
    2.5 重組 MDV 載體上不同位點轉(zhuǎn)錄 HA 基因活性的比較
        2.5.1 引物設(shè)計
        2.5.2 外源插入片段的擴增以及兩側(cè)同源臂的引入
        2.5.3 載體上不同位點表達 HA 基因的重組病毒的構(gòu)建
        2.5.4 重組病毒的拯救
        2.5.5 重組病毒生物學活性的的驗證
        2.5.6 不同重組病毒體外增殖速率的比較
        2.5.7 重組病毒感染的 CEF 中 HA 蛋白量的比較
        2.5.8 熒光定量
        2.5.9 重組病毒體內(nèi)復制檢測和抗體檢測
        2.5.10 攻毒保護實驗
3 結(jié)果與分析
    3.1 抗 H9N2-HA 鼠多價血清的制備及 H9N2-HA 真核表達載體的構(gòu)建
        3.1.1 HA 基因分兩段克隆測序
        3.1.2 HA 融合蛋白的誘導表達
        3.1.3 抗 H9-HA 鼠多克隆抗體的特異性鑒定
        3.1.4 H9N2-HA 基因的 RT-PCR 擴增
        3.1.5 HA 真核表達載體在 CEF 細胞上的驗證
    3.2 一株表達 H9N2-HA 基因的重組 rGX-CMV-HA 的構(gòu)建
        3.2.1 與 GX0101Δmeq 重組的外源插入表達盒的 PCR 擴增與測序
        3.2.2 兩個表達盒與 GX0101Δmeq 之間在 EL250 中的重組
        3.2.3 敲除抗性篩選基因 kanr
        3.2.4 IFA 驗證 HA 基因在重組 rGX-CMV-HA 中的表達
    3.3 不同啟動子在重組病毒中轉(zhuǎn)錄 H9N2-HA 活性的比較
        3.3.1 不同啟動子的克隆測序
        3.3.2 不同啟動子轉(zhuǎn)錄 HA 基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及驗證
        3.3.3 kanr基因和 HA 基因共表達載體的構(gòu)建
        3.3.4 HA 表達盒與 GX0101Δmeq 的重組
        3.3.5 kanr基因表達盒的敲除
        3.3.6 重組病毒中 HA 基因的表達
        3.3.7 重組病毒純度檢測
        3.3.8 不同重組病毒體外增殖速率的比較
        3.3.9 ELISA 方法比較不同重組病毒表達 HA 蛋白的水平
        3.3.10 相對 RT-PCR 熒光定量方法比較不同重組病毒轉(zhuǎn)錄 HA-mRNA 的水平
        3.3.11 重組病毒在體內(nèi)的復制
        3.3.12 抗體檢測
        3.3.13 攻毒免疫保護試驗
    3.4 GX0101ΔMeq 載體中不同插入位點轉(zhuǎn)錄 HA 基因的活性比較
        3.4.1 HA 表達盒與 GX0101ΔMeq 的重組及重組病毒的拯救
        3.4.2 重組病毒的驗證
        3.4.3 不同重組病毒體外增殖速率的比較
        3.4.4 ELISA方法比較不同重組病毒表達HA蛋白的水平
        3.4.5 相對RT-PCR熒光定量方法比較不同重組病毒轉(zhuǎn)錄HA-mRNA的水平
        3.4.6 重組病毒在體內(nèi)的復制
        3.4.7 抗體檢測
        3.4.8 攻毒免疫保護試驗
4 討論
5 結(jié)論
6 參考文獻
7 致謝
8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]馬立克氏病病毒meq基因敲除株感染性克隆的免疫效果評價[J]. 李延鵬,康孟佼,蘇帥,丁家波,崔治中,朱鴻飛.  微生物學報. 2010(07)
[2]敲除meq的雞馬立克氏病毒強毒株對超強毒的免疫保護作用[J]. 蘇帥,李延鵬,孫愛軍,趙鵬,丁家波,朱鴻飛,崔治中.  微生物學報. 2010(03)
[3]共表達H5亞型禽流感病毒HA基因和雞IL-2基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力研究[J]. 云水麗,張偉,劉武杰,張小榮,陳素娟,吳艷濤,彭大新,劉秀梵.  病毒學報. 2009(06)
[4]A BAC clone of MDV strain GX0101 with REV-LTR integration retained its pathogenicity[J]. LAWRENCE Petherbridge,NAIR Venugopal K.  Chinese Science Bulletin. 2009(15)
[5]雞馬立克氏病病毒814株細菌人工染色體的構(gòu)建[J]. 崔紅玉,王云峰,石星明,童光志,蘭德松,何來,仇華吉,劉長軍,王玫.  生物工程學報. 2008(04)
[6]兩株表達H9亞型禽流感病毒HA基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建及其免疫效力[J]. 劉武杰,孫蕾,陳素娟,徐忠林,劉金彪,劉秀梵.  畜牧獸醫(yī)學報. 2008(03)
[7]馬立克氏病病毒pp38基因產(chǎn)物對其上游雙向啟動子活性的增強作用[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,Sanjay Reddy.  中國科學（C輯:生命科學）. 2005(06)
[8]Ⅰ型馬立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表達[J]. 姜世金,丁家波,孟珊珊,崔治中,楊漢春.  中國病毒學. 2005(04)
[9]馬立克氏病病毒pp38基因和1.8kb轉(zhuǎn)錄子之間雙向啟動子的特性研究[J]. 丁家波,崔治中,姜世金,孫愛軍,孫淑紅.  微生物學報. 2005(03)
[10]Isolation of recombinant field strains of Marek’s disease virus integrated with reticuloendotheliosis virus genome fragments[J]. ZHANG Zhi & CUI Zhizhong Department of Preventive Veterinary Medicine, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agriculture University, Taian 271018, China.  Science in China（Series C:Life Sciences）. 2005(01)



本文編號：3152529