馬鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis,ER）是由馬皰疹病毒 Ⅰ 型（Equine herpes virus type 1,EHV-1）和馬皰疹病毒 Ⅳ 型（Equine herpesvirus type 4,EHV-4）引起的主要感染馬屬動(dòng)物的高度接觸性傳染病。該病不僅可以表現(xiàn)不同程度的呼吸道癥狀,EHV-1還可以導(dǎo)致流產(chǎn)和致死的馬脊髓性腦炎,給養(yǎng)馬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。UL16蛋白為EHV-1的皮層蛋白之一,由ORF46編碼,基因高度保守,在病毒復(fù)制和成熟過(guò)程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是制備EHV-1兔多克隆抗體,并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)獲取體外表達(dá)的UL16蛋白。利用蔗糖梯度離心法將EHV-1 438/77株進(jìn)行純化,將純化的病毒蛋白與弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化,分別對(duì)家兔進(jìn)行首次免疫和加強(qiáng)免疫制備免疫血清;通過(guò)Westerm Blot檢測(cè)顯示,制備的EHV-1兔免疫血清中的多抗與EHV-1全病毒蛋白結(jié)合反應(yīng)性良好。根據(jù)在GenBank上發(fā)表的ORF46基因的序列設(shè)計(jì)特異性引物,在引物末端引入EcoRI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn),通過(guò)PCR來(lái)擴(kuò)增目的片段。純化的PC... 

【文章來(lái)源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：43 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 引言
    1.1 馬鼻肺炎概述
    1.2 馬皰疹病毒的分型及其生物學(xué)特性
        1.2.1 馬皰疹病毒的分型
        1.2.2 病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)
        1.2.3 病毒的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.4 病毒的理化性質(zhì)
        1.2.5 主要蛋白功能
        1.2.6 致病機(jī)制
        1.2.7 潛伏感染
    1.3 臨床癥狀
    1.4 流行病學(xué)
    1.5 臨床診斷
    1.6 實(shí)驗(yàn)室診斷
        1.6.1 組織學(xué)診斷
        1.6.2 病毒的分離鑒定
        1.6.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
        1.6.4 血清中和實(shí)驗(yàn)
        1.6.5 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)
        1.6.6 直接免疫熒光
    1.7 馬鼻肺炎的防控措施
    1.8 疫苗的研究進(jìn)展
    1.9 本實(shí)驗(yàn)的目的和意義
2 試驗(yàn)一 EHV-1全病毒兔的多克隆抗體的制備
    2.1 材料
        2.1.1 細(xì)胞、毒株、及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器和耗材
    2.2 方法
        2.2.1 病毒感染滴度的測(cè)定
        2.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的增殖
        2.2.3 病毒的濃縮和純化
        2.2.4 病毒蛋白的乳化
        2.2.5 動(dòng)物免疫及免疫血清的制備
        2.2.6 多抗的Western Blot鑒定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 病毒感染滴度的測(cè)定結(jié)果
        2.3.2 病毒最適接毒量計(jì)算結(jié)果
        2.3.3 病毒超速離心結(jié)果
        2.3.4 兔多抗的Wetern Blot鑒定
3 試驗(yàn)二 EHV-1 UL16蛋白原核表達(dá)
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒、毒株及抗體
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器和耗材
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計(jì)
        3.2.2 UL16基因的獲取
        3.2.3 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        3.2.5 重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.6 重組UL16蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析
        3.2.7 重組UL16蛋白表達(dá)的Western Blot鑒定
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 PCR反應(yīng)結(jié)果
        3.3.2 重組克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.3 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果
        3.3.4 重組表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序及比對(duì)結(jié)果
        3.3.5 SDS-PAGE分析
        3.3.6 Western Blot鑒定
4 討論
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
作者簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]新疆伊犁地區(qū)馬皰疹病毒1型的分離鑒定及其gB和gD基因的序列分析[D]. 楊永龍.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]新疆2縣馬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查及兩種馬鼻肺炎間接ELISA檢測(cè)方法的比較研究[D]. 沙燕.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015
[3]馬皰疹病毒1型gB/gD雙基因原核表達(dá)蛋白免疫效果研究以及新疆部分地區(qū)馬鼻肺炎血清流行病學(xué)調(diào)查[D]. 李娜.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[4]EHV-8的分離鑒定和生物學(xué)特性分析[D]. 劉翠云.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2012
[5]馬鼻肺炎間接ELISA診斷方法的建立及血清學(xué)調(diào)查[D]. 陶虹.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 2002



本文編號(hào)：3151691