通過體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer,SCNT）技術(shù),終末分化的體細(xì)胞能夠被重編程至全能性狀態(tài),并最終發(fā)育成為動物個體。這一優(yōu)勢使得SCNT技術(shù)在動物育種、瀕危動物保護(hù)、疾病模型構(gòu)建、生物醫(yī)藥和人類治療性克隆等方面擁有廣泛的應(yīng)用前景。但是,克隆胚胎往往表現(xiàn)出不同階段的發(fā)育阻滯,這導(dǎo)致克隆動物的出生率很低;即使發(fā)育至最后,出生克隆動物也經(jīng)常表現(xiàn)出多種發(fā)育缺陷,這些因素成為SCNT技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要障礙。去分化不徹底和重編程不完全被認(rèn)為是核移植重編程效率低下的主要原因之一。本課題分別針對牛早期克隆胚胎中抑制性組蛋白修飾-H3K27me3和合子基因組激活時期的轉(zhuǎn)錄異常展開研究,鑒定出H3K27me3是牛核移植重編程的障礙,揭示了�？寺∨咛ブ写嬖趤碓从诠w細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄記憶,主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:（1）通過免疫熒光染色試驗,確定了牛早期SCNT胚胎中存在異常高比例的H3K27me3修飾。之后,我們試圖通過抑制H3K27me3甲基轉(zhuǎn)移酶-EZH2的活性、抑制EZH2的表達(dá)水平或者過表達(dá)H3K27me3去甲基化酶-KDM6A等三種方法來修正SCNT胚胎中H3K... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 動物早期胚胎發(fā)育
    1.1 脊椎動物早期卵裂
        1.1.1 快速卵裂的胚胎
        1.1.2 緩慢卵裂的胚胎
    1.2 母源-合子轉(zhuǎn)換
        1.2.1 卵源性物質(zhì)的降解
        1.2.2 合子基因組激活
        1.2.3 MZT的調(diào)控機制
第二章 體細(xì)胞核移植重編程
    2.1 動物體細(xì)胞核移植的研究
    2.2 核移植重編程中的分子事件
        2.2.1 供體細(xì)胞核膜破裂
        2.2.2 激活
        2.2.3 染色質(zhì)重構(gòu)
        2.2.4 表觀修飾的擦除與重建
    2.3 重編程效率的影響因素與改進(jìn)方法
        2.3.1 核移植供體細(xì)胞的選擇
        2.3.2 卵母細(xì)胞的選擇與去核
        2.3.3 克隆胚胎的體外培養(yǎng)
        2.3.4 異常組蛋白標(biāo)記的修正
        2.3.5 異常DNA甲基化的修正
        2.3.6 Xist基因異常表達(dá)的修正
第三章 �？寺∨咛ブ蠬3K27me3 的異常表達(dá)及修正
    3.1 材料和試劑
    3.2 方法
        3.2.1 原代細(xì)胞分離與培養(yǎng)
        3.2.2 卵母細(xì)胞的準(zhǔn)備
        3.2.3 體外受精
        3.2.4 體細(xì)胞核移植
        3.2.5 孤雌激活
        3.2.6 顯微注射
        3.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.8 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR和實時熒光定量PCR
        3.2.9 免疫熒光染色
        3.2.10 蛋白免疫印跡
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 牛附植前IVF和 SCNT胚胎中H3K27me3 表達(dá)水平的檢測
        3.3.2 GSK343 處理導(dǎo)致�？寺∨咛グl(fā)育阻滯
        3.3.3 EZH2 基因敲降抑制牛核移植胚胎發(fā)育能力
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 KDM6A過表達(dá)促進(jìn)牛核移植重編程效率
    4.1 材料和試劑
    4.2 方法
        4.2.1 動物組織RNA的提取
        4.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR
        4.2.3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.2.4 體外轉(zhuǎn)錄
        4.2.5 顯微注射
        4.2.6 亞硫酸氫鹽測序
        4.2.7 RNA-seq
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 牛KDM6A基因過表達(dá)載體的構(gòu)建
        4.3.2 KDM6A促進(jìn)牛核移植桑葚胚至囊胚轉(zhuǎn)換
        4.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制
        4.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對�；蚪M數(shù)據(jù)
        4.3.5 組間差異表達(dá)基因的生物學(xué)進(jìn)程分析
        4.3.6 KDM6A參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附相關(guān)基因的表達(dá)
        4.3.7 KDM6A參與調(diào)節(jié)X染色體連鎖基因和印跡基因的表達(dá)
        4.3.8 MBD3L2 敲降導(dǎo)致牛核移植重編程效率降低
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 牛核移植重編程中體細(xì)胞記憶的研究
    5.1 材料和試劑
    5.2 方法
        5.2.1 核移植供體細(xì)胞的準(zhǔn)備
        5.2.2 體細(xì)胞核移植
        5.2.3 孤雌激活
        5.2.4 體外受精
        5.2.5 RNA-seq
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)原始讀值的分布狀態(tài)
        5.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的比對結(jié)果
        5.3.3 BFF和 IVF8C差異表達(dá)基因的生物學(xué)進(jìn)程分析
        5.3.4 IVF8C和 NT8C差異表達(dá)基因的生物學(xué)進(jìn)程分析
        5.3.5 活化記憶基因與沉默記憶基因的鑒定
        5.3.6 BFF、IVF8C和 NT8C差異表達(dá)基因的生物學(xué)進(jìn)程分析
        5.3.7 供體細(xì)胞、體外受精胚胎和核移植胚胎整體轉(zhuǎn)錄水平的分析
        5.3.8 牛核移植重編程中待選體細(xì)胞記憶基因的展示
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 KDM5B通過對體細(xì)胞記憶基因的雙向調(diào)控改善牛核移植重編程
    6.1 材料和試劑
    6.2 方法
        6.2.1 動物組織RNA的提取
        6.2.2 反轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量PCR
        6.2.3 牛KDM5B基因過表達(dá)載體的構(gòu)建
        6.2.4 體細(xì)胞核移植
        6.2.5 孤雌激活
        6.2.6 體外轉(zhuǎn)錄
        6.2.7 顯微注射
        6.2.8 RNA-seq
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 KDM5B真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        6.3.2 KDM5B過表達(dá)改善牛核移植重編程效率
        6.3.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制
        6.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的比對結(jié)果
        6.3.5 KDM5B改善�？寺∨咛ズ献蛹せ顣r期的轉(zhuǎn)錄重編程
        6.3.6 KDM5B修正牛SCNT重編程中異常的體細(xì)胞記憶
        6.3.7 特定體細(xì)胞記憶基因表達(dá)模式的展示
    6.4 討論
    6.5 小結(jié)
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
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本文編號：3149409