Xist是產(chǎn)生一個(gè)非編碼RNA的與X染色體相關(guān)的基因,它是在合子期基因組開始激活,并且是胚胎早期發(fā)育表達(dá)的第一個(gè)印記基因。盡管Xist是在雌性動(dòng)物中參與X染色體失活,但Xist RNA的功能尚未被完全認(rèn)知。在動(dòng)物克隆胚胎發(fā)育中許多基因表達(dá)異常,Xist也是這些異常表達(dá)基因之一。前期研究表明,利用Xist基因缺陷型供體細(xì)胞用于克隆實(shí)驗(yàn),可成功將小鼠克隆效率提高8-9倍。本實(shí)驗(yàn)探討了TAALE載體轉(zhuǎn)染到胎牛成纖維細(xì)胞調(diào)控Xist基因表達(dá)的可行性,并且以抑制Xist基因表達(dá)的細(xì)胞作為供體制作克隆胚胎,研究Xist基因調(diào)控對(duì)�？寺∨咴缙诎l(fā)育影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)特異性抑制Xist表達(dá)載體TALER轉(zhuǎn)染雌性胎牛成纖維細(xì)胞,并用mCherry作為載體轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)的報(bào)告基因。通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選獲得陽性細(xì)胞后直接提取R.NA,反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA,與同一來源細(xì)胞系進(jìn)行Real time RT-PCR對(duì)Xist表達(dá)水平檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Xist舊對(duì)表達(dá)量下調(diào)93.85%,說明本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的載體轉(zhuǎn)染系統(tǒng)能夠有效限制Xist基因的表達(dá)。選取Xist基因抑制表達(dá)陽性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
目錄
縮略詞表
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 克隆進(jìn)展
        1.1.1 哺乳動(dòng)物克隆進(jìn)展
        1.1.2 克隆牛進(jìn)展
    1.2 X染色體失活
        1.2.1 X染色體失活機(jī)制
        1.2.2 X染色體印記失活和失活染色體的決定
        1.2.3 牛X染色體失活研究
        1.2.4 X-染色體與克隆動(dòng)物
    1.3 基因表達(dá)抑制調(diào)控TALER技術(shù)簡(jiǎn)介
        1.3.1 新型基因組編輯技術(shù)TALENs
        1.3.2 TALER基因抑制調(diào)控技術(shù)工作機(jī)制
第二章 胎牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染及XIST基因抑制表達(dá)細(xì)胞的獲取、篩選、鑒定
    前言
    1.1 材料
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.1.2 載體
        1.1.3 藥品和試劑
    1.2 方法
        1.2.1 胎牛成纖維細(xì)胞解凍與培養(yǎng)
        1.2.2 胎牛成纖維細(xì)胞DNA提取
        1.2.3 PCR引物設(shè)計(jì)與合成
        1.2.4 胎牛成纖維細(xì)胞性別鑒定PCR與瓊脂糖凝膠電泳
        1.2.5 胎牛成纖維細(xì)胞電轉(zhuǎn)染
        1.2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選
        1.2.7 細(xì)胞的凍存
        1.2.8 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        1.2.9 Xist引物篩選
        1.2.10 轉(zhuǎn)染后胎牛成纖維細(xì)胞Xist相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 胎牛成纖維細(xì)胞性別鑒定
        1.3.2 牛Xist引物篩選
        1.3.3 胎牛成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染、篩選
第三章 抑制供體細(xì)胞XIST基因表達(dá)對(duì)牛早期克隆胚發(fā)育的影響
    1.1 材料
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.1.2 藥品和試劑
    1.2 方法
        1.2.1 主要試劑配制
        1.2.2 顯微操作針的制備
        1.2.3 體細(xì)胞核移植
    1.3 結(jié)果
        1.3.1 體細(xì)胞核移植獲得早期胚胎效率比較
        1.3.2 轉(zhuǎn)染后陽性細(xì)胞做供體獲得早期克隆胚胎形態(tài)
第四章 討論
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3149070