豬瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）是豬瘟（classical swine fever， CSF）的病原。CSFV基因組為長(zhǎng)約12.3kb的單股正鏈RNA,僅含一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框架（Open reading frame,ORF）,編碼一個(gè)分子量約為438kDa、具有3898個(gè)氨基酸殘基的多聚蛋白。該多聚蛋白在病毒和宿主蛋白酶的水解作用下,形成4種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS5A蛋白由497個(gè)氨基酸殘基組成,在調(diào)節(jié)病毒基因組RNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程中發(fā)揮重要作用。為了研究與CSFV NS5A蛋白相互作用的宿主蛋白,我們構(gòu)建了NS5A誘餌表達(dá)質(zhì)粒和豬外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)文庫(kù),采用酵母雙雜交技術(shù)篩選得到了一個(gè)與NS5A相互作用的宿主蛋白,即真核翻譯延伸因子1A （eukaryotic translation elongation factor1A，eEF1A）。通過(guò)酵母共轉(zhuǎn)化、GST pulldown和免疫共沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)NS5A與eEF1A的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)4種截短表達(dá)的eEF1A突變體與NS5A分別進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn),結(jié)果表明,e... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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摘要
Abstract
圖表目錄
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 豬瘟病毒概述
        1.1.1 豬瘟病毒
        1.1.2 豬瘟病毒蛋白結(jié)構(gòu)及功能
    1.2 eEF1A蛋白的結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.1 eEF1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能
        1.2.2 eEF1A的結(jié)構(gòu)
        1.2.3 eEF1A的功能
        1.2.4 eEF1A與病毒相互作用的研究進(jìn)展
    1.3 蛋白相作的研究方法
        1.3.1 離體研究方法
        1.3.2 基于細(xì)胞的研究方法
        1.3.3 基于成像的研究方法
        1.3.4 蛋白組學(xué)研究方法
        1.3.5 生物信息學(xué)研究方法
    1.4 慢病毒表達(dá)系統(tǒng)
    1.5 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)
    1.6 研究的目的和意義
第二章 eEF1A蛋白與CSFV NS5A蛋白相互作用及其對(duì)豬瘟病毒的抑制作用研究
    2.1 材料和方法
        2.1.1 細(xì)胞、菌株、載體和毒株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 基因擴(kuò)增與克隆
        2.1.4 PBMC cDNA文庫(kù)的制備
        2.1.5 酵母雙雜交篩選與NS5A相互作用的蛋白
        2.1.6 eEF1A與NS5A的酵母共轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
        2.1.7 NS5A的原核表達(dá)及純化
        2.1.8 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及蛋白的真核表達(dá)
        2.1.9 GST pulldown試驗(yàn)
        2.1.10 免疫共沉淀試驗(yàn)
        2.1.11 截短表達(dá)的eEF1A與NS5A的免疫共沉淀試驗(yàn)
        2.1.12 上調(diào)eEF1A表達(dá)的PK-15細(xì)胞系的構(gòu)建
        2.1.13 上調(diào)eEF1A的表達(dá)對(duì)CSFV增殖的影響
        2.1.14 CSFV感染對(duì)eEF1A表達(dá)的影響
        2.1.15 CSFV IRES雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試驗(yàn)
        2.1.16 Western blot檢測(cè)
        2.1.17 熒光定量RT-PCR
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 酵母雙雜交篩選與NS5A相互作用的宿主蛋白
        2.2.2 酵母共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證eEF1A與NS5A的相互作用
        2.2.3 GST pulldown驗(yàn)證eEF1A與NS5A的相互作用
        2.2.4 免疫共沉淀試驗(yàn)驗(yàn)證eEF1A與NS5A的相互作用
        2.2.5 eEF1A結(jié)構(gòu)域I的N端是與NS5A相互作用的關(guān)鍵區(qū)域
        2.2.6 上調(diào)eEF1A表達(dá)抑制CSFV的增殖
        2.2.7 CSFV感染誘導(dǎo)eEF1A的表達(dá)上調(diào)
        2.2.8 eEF1A抑制CSFV IRES的活性
    2.3 討論
第三章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3149043