為構(gòu)建用于拯救流感病毒的雙向轉(zhuǎn)錄/表達載體,本研究以p EF4/myc-His B為骨架首次構(gòu)建了含有人源的EF1-α和pol I雙啟動子的載體p EZ,并通過報告基因證明其具有雙向轉(zhuǎn)錄/表達的功能。此外,基于p EZ載體分別構(gòu)建含有馬流感病毒（EIV）A/equine/Jilin/1/1989（H3N8）（JL89）株各個節(jié)段c DNA的8個重組質(zhì)粒,且其中HA節(jié)段通過點突變技術(shù)引入分子遺傳標記（HindⅢ和NdeⅠ酶切位點）。將8個重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,拯救出病毒（r JL89）。病毒滴度測定顯示,拯救的第一代病毒具有較高的病毒滴度（2.38×105 TCID50/m L）;序列分析表明,r JL89與JL89的各個節(jié)段的序列幾乎一致性（99.9%¹00%）;酶切鑒定表明,r JL89穩(wěn)定攜帶分子遺傳標記（HindⅢ和NdeⅠ酶切位點）;血凝效價測定表明,r JL89與JL89有相同的血凝效價（28）;生長動力學研究顯示,r JL89具有與JL89相同的生物學特性。以上結(jié)果證明,基于p EZ載體建立了EIV JL89株的8質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng),該系統(tǒng)可以拯救... 

【文章來源】：中國預防獸醫(yī)學報. 2016,38(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

綠色熒光的檢測Fig.3Identification of green fluorescence

以真核表達載體p EF4/myc-His B為骨架進行改造:在其KpnⅠ和BclⅠ酶切位點之間插入必需元件(Insert 1)-鼠源的polⅠ終止子(Tpol I,33 bp)、Bsm BⅠ酶切位點和人源的polⅠ啟動子(Ppol I,236 bp)序列;在其SphⅠ和Bsp QⅠ酶切位點之間插入一段Linker(5"-CTGGG GATGCGGTGGGCTCTATG-3")(Insert 2),替換原載體上從f1 ori到SV40 poly A信號之間的非必需元件(圖1)。改造后的載體命名為p EZ。1.3 雙向轉(zhuǎn)錄/表達功能的鑒定

p EZ-v EGFP的構(gòu)建Fig.2Construction of p EZ-v EGFP


本文編號：3137347