豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus, PCV）為圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬成員。根據(jù)致病性、抗原性及核苷酸序列不同可將豬圓環(huán)病毒分為兩個(gè)型：豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）與豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）。一般認(rèn)為PCV1沒有致病性,而PCV2則可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭癥（PMWS）、母豬繁殖障礙、豬增生性和壞死性肺炎,豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）以及豬的先天性震顫（CT）等疾病。該病毒在全球各地廣泛流行,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前,豬圓環(huán)病毒�。≒CVD）尚無有效的治療方法,主要是以疫苗預(yù)防為主。由于PCV2在細(xì)胞上增殖滴度低、體外培養(yǎng)困難,而且病毒復(fù)制機(jī)理尚不清楚,這給PCVD的防治帶來了很大的障礙。本研究共構(gòu)建了四個(gè)含有EGFP或Rluc報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子及三個(gè)非復(fù)制子對(duì)照。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,本研究構(gòu)建的基于Rluc報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子具有較好的活性。該復(fù)制子既可為體外進(jìn)一步研究PCV復(fù)制機(jī)制奠定基礎(chǔ),又可為抗病毒先導(dǎo)化合物的篩選提供新方法。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下：（1）基于EGFP、Rluc報(bào)告基因標(biāo)記的PCV2復(fù)制子的構(gòu)建通過PCR方法,從含有PCV2... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
1. 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬圓環(huán)病毒概述
    1.2 豬圓環(huán)病毒的理化特性
    1.3 豬圓環(huán)病毒的基因組特點(diǎn)
    1.4 豬圓環(huán)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄
    1.5 豬圓環(huán)病毒的主要功能蛋白
        1.5.1 Rep蛋白
        1.5.2 Cap蛋白
        1.5.3 其他蛋白
    1.6 豬圓環(huán)病毒的復(fù)制機(jī)理研究進(jìn)展
    1.7 病毒與宿主的相互作用
2. 目的意義
3. 材料與方法
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要試劑及溶液的配制
            3.1.3.1 抗生素類
            3.1.3.2 培養(yǎng)基
            3.1.3.3 其它溶液
        3.1.4 引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段
        3.2.2 目的DNA片段的純化回收
        3.2.3 目的片段的連接
        3.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.2.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.2.6 質(zhì)粒的少量提取與酶切鑒定
            3.2.6.1 質(zhì)粒的少量提取
            3.2.6.2 質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.2.7 質(zhì)粒的大量制備
        3.2.8 細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代、凍存
            3.2.8.1 細(xì)胞的復(fù)蘇
            3.2.8.2 細(xì)胞的傳代
            3.2.8.3 細(xì)胞的凍存
        3.2.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        3.2.10 EGFP蛋白的定量檢測(cè)
        3.2.11 海腎熒光素酶活性檢測(cè)
        3.2.12 細(xì)胞總DNA的提取
        3.2.13 熒光定量PCR
4. 結(jié)果與分析
    4.1 基于EGFP報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子的構(gòu)建及驗(yàn)證
        4.1.1 復(fù)制子質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.1.1.1 PCV2 ORF1基因的擴(kuò)增
            4.1.1.2 pIRES2-ORF1-EGFP質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.1.1.3 復(fù)制子pT-Ori-ORF1-IRES-EGFP和非復(fù)制子pT-ORF1-IRES-EGFP的構(gòu)建
        4.1.2 復(fù)制子活性的初步檢測(cè)
            4.1.2.1 熒光強(qiáng)度與轉(zhuǎn)染EGFP細(xì)胞蛋白的相關(guān)性分析
            4.1.2.2 轉(zhuǎn)染復(fù)制子與非復(fù)制子后熒光強(qiáng)度的比較
    4.2 基于Rluc報(bào)告基因的PCV2復(fù)制子的構(gòu)建及驗(yàn)證
        4.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.1.1 PCV2 ORF1的克隆
            4.2.1.2 Rluc基因的克隆
            4.2.1.3 質(zhì)粒pc-Rluc的構(gòu)建
            4.2.1.4 質(zhì)粒pc-Rluc-2A-ORF1的構(gòu)建
            4.2.1.5 復(fù)制子pT-Ori-Rluc-2A-ORF1和非復(fù)制子pT-Rluc-2A-ORF1的構(gòu)建
        4.2.2 復(fù)制子活性的初步檢測(cè)
    4.3 PCV2復(fù)制子的優(yōu)化
        4.3.1 PCV2復(fù)制起始區(qū)Ori的擴(kuò)增
        4.3.2 復(fù)制子質(zhì)粒pc-Ori-Rluc-2A-ORF1和pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的構(gòu)建
            4.3.2.1 復(fù)制子質(zhì)粒pc-Ori-Rluc-2A-ORF1的構(gòu)建
            4.3.2.2 復(fù)制子質(zhì)粒pc-Rluc-2A-ORF1-Ori的構(gòu)建
    4.4 PCV2復(fù)制子活性檢測(cè)條件的優(yōu)化
        4.4.1 最佳檢測(cè)時(shí)間的確定
        4.4.2 最佳轉(zhuǎn)染劑量的確定
    4.5 利巴韋林對(duì)PCV2復(fù)制子活性的影響
        4.5.1 利巴韋林對(duì)復(fù)制子蛋白表達(dá)的影響
        4.5.2 利巴韋林對(duì)復(fù)制子拷貝數(shù)的影響
5. 討論與結(jié)論
    5.1 討論
        5.1.1 復(fù)制子系統(tǒng)
        5.1.2 報(bào)告基因
        5.1.3 PCV2復(fù)制子的構(gòu)建及優(yōu)化
        5.1.4 復(fù)制子活性檢測(cè)條件的優(yōu)化
        5.1.5 利巴韋林對(duì)PCV2復(fù)制子活性的影響
            5.1.5.1 利巴韋林對(duì)復(fù)制子蛋白表達(dá)的影響
            5.1.5.2 利巴韋林對(duì)復(fù)制子拷貝數(shù)的影響
    5.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3137324