日本血吸蟲(chóng)病是一種危害嚴(yán)重的人畜共患寄生蟲(chóng)病,仍是我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。截止到2013年底,我國(guó)仍推算有血吸蟲(chóng)病人18多萬(wàn)例。至今,仍沒(méi)有理想的血吸蟲(chóng)病疫苗可在現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用,血吸蟲(chóng)病防治仍主要依靠大規(guī)模的吡喹酮化療,且已有血吸蟲(chóng)對(duì)吡喹酮產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道。因此,迫切需要篩選治療血吸蟲(chóng)病新藥物。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種主要方式,日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的研究可為日本血吸蟲(chóng)新藥靶的篩選提供新思路。本研究通過(guò)對(duì)日本血吸蟲(chóng)全基因組信息挖掘,鑒定了15個(gè)日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因。通過(guò)RT-PCR技術(shù)分析了這些凋亡相關(guān)基因在適宜性宿主BALB/c小鼠和非適宜性宿主Wistar大鼠來(lái)源的不同時(shí)期的日本血吸蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)差異,對(duì)其中重要的差異表達(dá)基因Sjcaspase3/7進(jìn)行了克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析,為深入研究日本血吸蟲(chóng)凋亡機(jī)制和新藥靶的鑒定奠定了基礎(chǔ)。1.大、小鼠來(lái)源日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析分別收集了BALB/c小鼠和Wistar大鼠來(lái)源14d,23d,32d,42d四個(gè)時(shí)期共八組日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體,利用Trizol提取蟲(chóng)體的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用日本血吸蟲(chóng)全基因組本地B... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 血吸蟲(chóng)與血吸蟲(chóng)病
    1.2 血吸蟲(chóng)病需要新的治療方法
    1.3 細(xì)胞凋亡
        1.3.1 細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死
        1.3.2 細(xì)胞凋亡的典型特征
    1.4 細(xì)胞凋亡通路
        1.4.1 死亡受體通路
        1.4.2 線粒體通路
        1.4.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路
    1.5 日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞凋亡觀察
        1.5.1 蟲(chóng)體形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察
        1.5.2 細(xì)胞水平觀察
        1.5.3 染色體水平觀察
        1.5.4 基因水平觀察
    1.6 日本血吸蟲(chóng)重要凋亡基因的研究
    1.7 日本血吸蟲(chóng)半胱天冬酶（Caspase）家族相關(guān)研究
    1.8 日本血吸蟲(chóng)凋亡與藥物靶點(diǎn)的研究
    1.9 本文總體研究思路
第二章 大、小鼠來(lái)源日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析
    2.1. 引言
    2.2. 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.1 生物材料
        2.2.2 主要試劑和酶
        2.2.3 主要儀器
    2.3. 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 日本血吸蟲(chóng)全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)建立
        2.3.2 日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因搜索
        2.3.3 日本血吸蟲(chóng)蟲(chóng)體的收集
        2.3.4 各期別日本血吸蟲(chóng)cDNA模板的制備
        2.3.5 RT-PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量
    2.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.4.1 日本血吸蟲(chóng)全基因組本地BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)建立
        2.4.2 日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因的搜索
        2.4.3 大、小鼠來(lái)源不同時(shí)期日本血吸蟲(chóng)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)分析
    2.5. 討論
第三章 日本血吸蟲(chóng)凋亡基因Sjcaspase7的克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.1. 生物材料
        3.2.2. 主要試劑和酶
        3.2.3. 主要儀器
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1. RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
        3.3.2. Sjcaspase7基因的克隆
        3.3.3. 構(gòu)建pXJ40-FLAG-Sjcaspase7真核表達(dá)質(zhì)粒
        3.3.4. pXJ40-FLAG-Sjcaspase7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞
        3.3.5. 間接免疫熒光檢測(cè)rSjcaspase7重組蛋白表達(dá)
        3.3.6. Western Blotting分析重組蛋白rSjcaspase7
        3.3.7. 抑制劑對(duì)Caspase酶活力抑制作用分析
        3.3.8. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.3.9. RT-PCR分析Sjcaspase7在各時(shí)期蟲(chóng)體中的表達(dá)
        3.3.10. 體外共轉(zhuǎn)染篩選Sjcaspase7小干擾RNA（SiRNA）
        3.3.11. Sjcaspase7基因體內(nèi)干擾
        3.3.12. RT-PCR分析Sjcaspase7表達(dá)水平
        3.3.13. 蟲(chóng)體Caspase酶活檢測(cè)
    3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.4.1. PCR擴(kuò)增日本血吸蟲(chóng)Sjcaspase7基因
        3.4.2. IFA檢測(cè)rSjcaspase7重組蛋白的表達(dá)
        3.4.3. Western Blotting分析rSjcaspase7重組蛋白
        3.4.4. 抑制劑對(duì)Caspase酶活力抑制作用分析
        3.4.5. 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
        3.4.6. Sjcaspase7在各時(shí)期蟲(chóng)體中表達(dá)量
        3.4.7. 體外篩選Sjcaspase7優(yōu)選小干擾RNA（ SiRNA ）
        3.4.8. RT-PCR分析Sjcaspase7的表達(dá)水平
        3.4.9. 蟲(chóng)體Caspase酶活力檢測(cè)
        3.4.10.干擾后誘導(dǎo)的減蟲(chóng)和減卵效果
    3.5 討論
第四章 日本血吸蟲(chóng)凋亡基因Sjcaspase3的克隆、真核表達(dá)及生物學(xué)功能分析
    4.1. 引言
    4.2. 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1. 生物材料
        4.2.2. 主要試劑和酶
        4.2.3. 主要儀器
    4.3. 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1. Sjcaspase3基因的克隆
        4.3.2. 生物信息學(xué)分析
        4.3.3. RT-PCR分析Sjcaspase3在各期別蟲(chóng)體中的表達(dá)量
        4.3.4. pXJ40-FLAG-SjCaspase3重組質(zhì)粒構(gòu)建
        4.3.5. 轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞
        4.3.6. RT-PCR分析Sjcaspase3基因在Hela細(xì)胞中的表達(dá)
        4.3.7. Western Blotting分析Sjcaspase3蛋白表達(dá)
        4.3.8. rSjcaspase3重組蛋白的純化
        4.3.9. Caspase酶活檢測(cè)
        4.3.10. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    4.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1. Sjcaspase3基因克隆和生物信息學(xué)分析
        4.4.2. Sjcaspase3在各期別蟲(chóng)體中的表達(dá)
        4.4.3. 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞Sjcaspase3基因轉(zhuǎn)錄水平分析
        4.4.4. Western Blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞Sjcaspase3蛋白表達(dá)情況
        4.4.5. rSjcaspase3重組蛋白的純化
        4.4.6. 酶活檢測(cè)
        4.4.7. 流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    4.5. 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[6]2009年全國(guó)血吸蟲(chóng)病疫情通報(bào)[J]. 郝陽(yáng),鄭浩,朱蓉,郭家鋼,王立英,陳朝,周曉農(nóng).  中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志. 2010(06)
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[8]小鼠感染日本血吸蟲(chóng)后肝組織Bcl-2、Bax的表達(dá)及己酮可可堿對(duì)它的作用[J]. 魏屏,羅端德,熊莉娟,曾令蘭.  中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志. 2005(06)
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博士論文
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[2]不同宿主來(lái)源日本血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)差異表達(dá)基因的研究[D]. 彭金彪.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2010

碩士論文
[1]日本血吸蟲(chóng)凋亡誘導(dǎo)因子SjAIF的初步研究[D]. 陸看.上海師范大學(xué) 2015
[2]日本血吸蟲(chóng)細(xì)胞凋亡的初步觀察[D]. 郭小勇.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2014
[3]日本血吸蟲(chóng)基因SjCaspase9的克隆、表達(dá)及免疫保護(hù)效果的初步評(píng)估[D]. 王飛.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
[4]Stat3對(duì)Snail的調(diào)控及在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用[D]. 賀紅柳.鄭州大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3119343