蜘蛛絲是自然界具有最優(yōu)異力學(xué)性能的生物纖維,主要成分為蛛絲蛋白,但是難以大量生產(chǎn)或收集。利用基因工程手段可實現(xiàn)蛛絲蛋白基因轉(zhuǎn)入異源宿主中并表達。本實驗通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將蜘蛛牽絲蛋白基因真核表達載體pK-2S轉(zhuǎn)入美利奴細毛羊胎兒皮膚成纖維細胞中,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)入蛛絲蛋白基因的細胞株,通過DNA,RNA水平的檢測初步鑒定基因是否轉(zhuǎn)入細胞并表達,為培育能生產(chǎn)含有蛛絲蛋白羊毛的綿羊新品種奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：1.以已發(fā)表的棒絡(luò)新婦蛛cDNA片段為模板,人工合成擬蜘蛛牽絲蛋白基因單體（S）,并獲得二聚體（2S）。2.建立了新疆美利奴細毛羊胎兒成纖維細胞系,細胞形態(tài)觀察顯示細胞形態(tài)良好,生長曲線表明細胞增殖狀態(tài)較好,核型分析正常。3.克隆了綿羊毛囊特異性表達啟動子Kap6.1,構(gòu)建表達載體pKap-EGFP并轉(zhuǎn)入細毛羊胎兒皮膚成纖維細胞中并表達綠色熒光蛋白,表明啟動子具有表達活性。4.以pEGFP-N1為框架,將2S與綿羊毛囊特異性啟動子Kap6.1相連,構(gòu)建毛囊特異表達載體pK-2S。5.質(zhì)粒pK-2S線性化后,轉(zhuǎn)染新疆美利奴細毛羊胎兒皮膚成纖維細胞,并通過600μg/mL G418篩選單克隆。提... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

無縫克隆法步驟Figl：ProcedureofoneStepCloning

回收載體片段3.2kb。然后將載體片段與目的基因進行連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取和酶切鑒定（見圖5)，結(jié)果切出l.lkb目的片段，獲得擬蛛牽絲蛋白基因二聚體（2S)。bp M 1 22000麵750500 H|^KH100圖5載體pUC57-2S酶切鑒定Fig.5 Identification of pUC57-2S by enzyme digestion注:M.DL2000;1，2.酶切產(chǎn)物，2.3討論目前，人們所獲得的購蛛絲基因序列都是通過蛋白水解獲得肽段，通過肽段獲得其cDNA序列合成基因，尚未有_蛛全基因組測序完成的報道，因此分離獲得全長的妹絲蛋白編碼基因比較困難。蛛絲蛋白的氨基酸組成主要包括甘氨酸和丙氨酸

較遠處為成纖維細胞；接種5d-6d后，組織塊周圍游離出的成纖維細胞已匯合成片（如圖6中A)，從生長狀況可以看出細胞活力較好，形態(tài)健康，達到一定濃度后，進行消化傳代。通常以1:3的比例進行傳代，傳代后的細胞一般約2d-3d己長滿單層，可進行再傳代。根據(jù)成纖維細胞與上皮樣細胞對胰蛋白酶的敏感性不同進行成纖維細胞的純化，上皮樣細胞一般需要5niin以上才會從瓶底脫落，因此，在傳代時控制消化時間，保持Imin左右，經(jīng)過2-3次的傳代即獲得較純的成纖維細胞（如圖6中B圖）。前十代細胞生長速度快，活力旺盛，形態(tài)較好，細胞復(fù)蘇后一般會有少量細胞死亡，換液后繼續(xù)培養(yǎng)

【參考文獻】：
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碩士論文
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本文編號：3119454