肌型磷酸果糖激酶（PFKM）是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-雙磷酸的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶,在機(jī)體葡萄糖代謝、肌肉發(fā)育等多個生物過程中起關(guān)鍵作用。根據(jù)豬PFKM序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)設(shè)計(jì)sgRNA序列并構(gòu)建CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒。敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬PK15細(xì)胞并經(jīng)嘌呤霉素篩選,極限稀釋法篩選出單細(xì)胞克隆,提取各個細(xì)胞克隆DNA,利用PCR擴(kuò)增敲除區(qū)域序列,通過序列測定確定是否敲除成功,利用實(shí)時熒光定量PCR及Western blot分別檢測PFKM mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒篩選到的單細(xì)胞克隆中,有2株細(xì)胞PFKM基因序列發(fā)生基因突變,其中1個克隆為堿基插入,另1個為堿基插入、替換及缺失; qRT-PCR定量檢測結(jié)果表明,篩選到1株細(xì)胞PFKM mRNA表達(dá)量下降89.41%,差異極顯著。Western blot檢測結(jié)果表明,與正常細(xì)胞組相比, 2組敲除細(xì)胞株中PFKM蛋白表達(dá)量分別下降78.77%、81.63%,差異顯著。這一研究顯示利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功獲得了2株P(guān)FKM基因敲除細(xì)胞株,為后續(xù)研究PFKM基因在豬肌肉發(fā)育、能量代... 

【文章來源】：揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2020,41(04)北大核心

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【部分圖文】：

PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)測序峰圖

圖1 PFKM-KO2 (A)及PFKM-KO4 (B)測序峰圖引物退火后,將退火產(chǎn)物與YSY線性化CRISPR/Cas9質(zhì)粒連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR擴(kuò)增并測序,比對結(jié)果表明,目標(biāo)質(zhì)粒中含有sgRNA序列,說明目標(biāo)質(zhì)粒pPFKM-KO構(gòu)建成功。

PFKM是近年來發(fā)現(xiàn)的糖酵解過程中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶,可作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-雙磷酸,這一過程是不可逆反應(yīng),對機(jī)體生長發(fā)育、器官形成具有調(diào)控作用[12]。在家畜家禽中已證明PFKM基因表達(dá)變化與肉質(zhì)有直接的關(guān)聯(lián)性[4]。本課題組前期也發(fā)現(xiàn),不同品種豬肌肉組織中PFKM蛋白表達(dá)豐度有顯著差異。本研究擬利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)篩選PFKM基因敲除細(xì)胞株,用于后續(xù)基因功能檢測,在已有的調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)中, CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)相比之前傳統(tǒng)的cre-loxp基因同源重組、ZFN和TALEN基因編輯系統(tǒng),載體合成簡單、基因編輯效率高,因而是近年來生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的基因編輯系統(tǒng)[13]。本研究首先根據(jù)PFKM基因的序列,分析其基因組DNA結(jié)構(gòu),敲除位點(diǎn)選擇在第8外顯子位置并設(shè)計(jì)PFKM sgRNA序列;在單細(xì)胞克隆的篩選過程中,為提高效率,本研究在轉(zhuǎn)染36 h后,用嘌呤霉素進(jìn)行篩選(時間過長會影響細(xì)胞狀態(tài),過短則會影響轉(zhuǎn)染效率),可大大減少后期細(xì)胞克隆中陰性細(xì)胞克隆的比例。篩選出單細(xì)胞克隆后,首先對篩選出的單細(xì)胞克隆進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域PFKM第8外顯子序列擴(kuò)增及測定,考慮到外顯子區(qū)域敲除后不一定影響mRNA表達(dá)及蛋白的生成,因此本研究在DNA確定敲除的情況下,將篩選出的2個目標(biāo)區(qū)域發(fā)生基因突變的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后分別檢測PFKM mRNA及蛋白質(zhì)量,其中PFKM-KO2細(xì)胞株中PFKM mRNA表達(dá)量與正常細(xì)胞株相比,未見顯著變化,但蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯降低,可能發(fā)生突變的區(qū)域不影響該基因的正常轉(zhuǎn)錄,外顯子區(qū)域從第10個氨基酸(組氨酸變成蘇氨酸)開始發(fā)生改變,進(jìn)而影響相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。PFKM-KO4株P(guān)FKM mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著下降,可能外顯子區(qū)域發(fā)生突變后,導(dǎo)致PFKM mRNA形成不同的拼接形式,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平降低,不能正常表達(dá)PFKM蛋白[14]。本研究在DNA、mRNA及蛋白質(zhì)3個層面進(jìn)行了全面檢測PFKM基因敲除情況,成功篩選出2株P(guān)FKM基因敲除細(xì)胞株。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]應(yīng)用CRISPR/Cas9敲除HeLa細(xì)胞DDX21基因?qū)π鲁且卟《緩?fù)制的影響[J]. 武煒,王颯,孟春春,仇旭升,廖瑛,譚磊,宋翠萍,劉煒瑋,孫英杰,丁鏟.  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2019(07)
[2]小鼠MSTN shRNA設(shè)計(jì)及其活性檢測[J]. 祁鈺鈺,楊躍飛,楊開典,鞠輝明.  揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2015(03)
[3]miRNA-143表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)活性檢測[J]. 姜星,生安志,白立景,鞠輝明.  揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版). 2012(03)

博士論文
[1]激活誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶基因在斑馬魚中的功能研究[D]. 竺林.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014



本文編號：3105793