為闡明豬支原體HspA1的生物學(xué)特性,本研究構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-HspA1,原核表達HspA1重組蛋白并純化;以純化的HspA1蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,通過常規(guī)方法制備單克隆抗體,利用間接ELISA方法檢測單克隆抗體效價,通過Western-blot檢測單克隆抗體的特異性。結(jié)果顯示,本研究成功篩選出以4B4、2G2命名的2株雜交瘤細胞,其抗體分泌穩(wěn)定;這2株雜交瘤細胞特異性好,與HspA1重組蛋白均能發(fā)生特異性反應(yīng);這2株雜交瘤細胞識別的抗原表位相同,單抗亞型均為Ig G1、κ鏈;4B4、2G2的細胞上清和腹水的ELISA抗體效價分別為:1∶3 200、1∶800和1∶13 107 200、1∶819 200。 

【文章來源】：中國獸醫(yī)科學(xué). 2020,50(12)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

所示，2株雜交瘤細胞株的染色體數(shù)目均大于99，且小于108

inereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)；4：Streptococcussuis.45min；加入固定液預(yù)固定；重復(fù)固定2次，滴片，吉姆薩染色。置全自動倒置熒光顯微鏡（LeicaDMI-6000B）觀察雜交瘤細胞染色體形態(tài)并計數(shù)。1.7.4抗體分泌穩(wěn)定性及效價測定用間接ELISA法測定雜交瘤細胞效價。將4B4和2G2連續(xù)傳代，并及時凍存。傳至15代，取細胞上清，同時復(fù)蘇凍存的雜交瘤細胞，檢測抗體效價。2結(jié)果2.1抗原蛋白的制備和鑒定通過優(yōu)化表達條件，成功表達HspA1蛋白，并利用帶His標(biāo)簽的柱子純化該蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示（見圖1），HspA1蛋白大小約為70ku，蛋白純化效果好。2.2間接ELISA篩選方法建立利用方陣滴定法確立抗原最佳稀釋濃度為1∶800，約為0.2g/mL，陰性與陽性血清的稀釋比例為1∶1600。2.3雜交瘤細胞株的篩選斑點雜交法測得小鼠血清效價均達到1∶20000，取脾細胞與SP2/0細胞融合。將篩得的雜交瘤細胞株分別命名為4B4、2G2。間接ELISA方法檢測4B4、2G2的細胞上清效價分別為1∶3200、1∶800，腹水效價分別為1∶13107200、1∶819200。2.4Mab特異性鑒定Western-blot鑒定結(jié)果顯示（見圖2）：雜交瘤細胞株4B4、2G2均能特異性識別70ku的HspA1重組蛋白，與豬繁殖與呼吸綜合征、豬鏈球菌抗原蛋白不發(fā)生交叉反應(yīng)。2.5MAb的Ig亞型鑒定抗體亞型鑒定結(jié)果表明：4B4、2G2亞型均為：IgG1、κ鏈。ELISA疊加法結(jié)果表明，4B4、2G2之間的疊加系數(shù)43.9％，表明這2株雜交瘤細胞株識別的抗原表位相同（見表1）。2.6雜交瘤細胞染色體染色計數(shù)試驗對4B4和2G2進行雜交瘤細胞染色體染色計數(shù)試驗，結(jié)果如圖3所示，2株雜交瘤細胞株的染色體數(shù)目均大于99，且小于108。小鼠及SP2/0細胞的染色體數(shù)目分別為40和68。雜交瘤細胞的染色體數(shù)目約為

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
[1]豬嗜血支原體PCR和ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用[D]. 張長瑩.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



本文編號：3105891