隨著轉基因技術的發(fā)展,獲得特異性強且無生物安全隱患的高效啟動子成為研究熱點。本實驗以蛻皮素誘導系統(tǒng)為介導,在實驗室前期已經(jīng)分離獲得的具有較高調控能力兼具肌肉組織特異性表達的a-actin啟動子的基礎上,將蛻皮素誘導系統(tǒng)調節(jié)質粒中可廣譜表達外源基因的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性啟動子a-actiin。構建豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng),并在細胞水平上驗證該肌肉特異性誘導系統(tǒng)在表達外源基因時是否兼?zhèn)浣M織特異性和可調控性,為基因治療和外源基因在骨骼肌組織的特異性表達提供實驗依據(jù)。主要研究結果如下：1.將蛻皮素誘導表達系統(tǒng)調節(jié)質粒pVgRXR中的CMV啟動子替換為豬肌肉特異性表達的a-actin啟動子,選取綠色熒光蛋白EGFP為報告基因構建誘導系統(tǒng)中的反應質粒pIND-EGFP,用于檢測雙載體表達系統(tǒng)是否可以成功表達外源基因。研究結果表明,本研究構建的肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)可啟動外源基因的表達。2.將以上系統(tǒng)中的EGFP報告基因替換為p-半乳糖苷酶LacZ基因用于檢測該系統(tǒng)的表達活性。實驗結果顯示該誘導系統(tǒng)報告基因表達量在一定的范圍內均與誘導時間和誘導劑量呈正比例關系,分別在誘導時間為72h和誘導... 

【文章來源】：華中農業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
中英文縮寫對照表
第一章 文章綜述
    1 前言
    2 組織特異性啟動子
    3 骨骼肌特異性表達基因a-actin的研究進展
    4 蛻皮素誘導系統(tǒng)
    5 研究目的和意義
第二章 材料和方法
    1 實驗材料
        1.1 主要儀器和設備
        1.2 所用實驗試劑
        1.3 所用載體和細胞
        1.4 常用試劑的配制
            1.4.1 細胞培養(yǎng)所用試劑的配制
            1.4.2 β-半乳糖苷酶活性檢測所需試劑的配制
        1.5 主要生物學軟件
    2 實驗方法
        2.1 調節(jié)質粒pVg-actin載體的構建方案
            2.1.1 載體重組的引物設計
            2.1.2 PCR產物的檢測、回收及純化
            2.1.3 PCR產物的加尾及純化
            2.1.4 PCR產物的克隆及測序
            2.1.5 T-actin和T-ZP的小量提取及酶切回收
            2.1.6 T-actin和T-ZP的酶切鑒定及片段的回收
            2.1.7 T-ZP-actin的小量提取及酶切回收
            2.1.8 pVg-actin的小量提取及酶切鑒定
        2.2 反應質粒pIND-LacZ和pIND-MyoD載體的構建
            2.2.1 重組質粒pIND-LacZ的小量提取及酶切鑒定
            2.2.2 MyoD基因片段的擴增
            2.2.3 pVg-actin以及pIND-MyoD可用于細胞轉染的質粒小量提取
        2.3 C2C12細胞系培養(yǎng)
            2.3.1 凍存細胞的復蘇
            2.3.2 細胞的培養(yǎng)和傳代
            2.3.3 細胞的凍存
            2.3.4 C2C12細胞的誘導分化
            2.3.5 G418篩選C2C12細胞的預實驗
            2.3.6 C2C12細胞的瞬時轉染
            2.3.7 C2C12細胞的穩(wěn)定篩選
            2.3.8 細胞總RNA的提取
            2.3.9 細胞總蛋白濃度測定
            2.3.10 β-半乳糖苷酶活性的檢測
            2.3.11 β-半乳糖苷酶標準曲線的建立
            2.3.12 數(shù)據(jù)的處理及分析
第三章 結果和分析
    1 豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)的構建
        1.1 調節(jié)質粒pV-actin載體的構建
            1.1.1 豬α-actin啟動子和ZP片段的獲得
            1.1.2 T-actin及T-ZP的構建及酶切回收
            1.1.3 T-ZP-actin的構建及酶切回收
            1.1.4 pVg-actin的構建及酶切鑒定
        1.2 反應質粒pIND-EGFP/pIND-LacZ/pIND-MyoD載體的構建
            1.2.1 pIND-EGFP載體的構建和酶切鑒定
            1.2.2 pIND-LacZ載體的構建和酶切鑒定
            1.2.3 pIND-MyoD載體的構建和酶切鑒定
        1.3 C2C12細胞系的穩(wěn)定篩選及誘導分化
            1.3.1 C2C12細胞的誘導分化
            1.3.2 細胞轉染pVg-actin/pIND-EGFP質粒熒光檢測
            1.3.3 陽性克隆細胞的檢測
    2 β-半乳糖苷酶含量檢測
        2.1 pVg-actin/pIND-LacZ系統(tǒng)中β-GaL表達量與誘導時間的關系
        2.2 pVg-actin/pIND-LacZ系統(tǒng)中β-GaL表達量與誘導濃度的關系
        2.3 不同時期肌管中β-GaL表達量與誘導濃度的關系
        2.4 小結
    3 pVg-actin/pIND-MyoD載體轉染小鼠肌管在mRNA水平上的檢測
第四章 討論
    1 β-半乳糖苷酶報告系統(tǒng)的作用
    2 組織特異性啟動子
    3 真核表達載體的構建
    4 穩(wěn)定轉染細胞系的構建
    5 MyoD基因
    6 豬肌肉特異性誘導表達系統(tǒng)的功能驗證
第五章 結論
參考文獻
附錄
    附錄1 α-actin啟動子序列（268 bp）
    附錄2 ZP上游序列（1620 bp）
    附錄3 ZP-actin序列（1900 bp）
    附錄4 MyoD序列（960 bp）
    附錄5 EGFP序列（798bp）
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]報告基因及其應用研究進展[J]. 楊宇,李江江,王項,邱冠周.  生命科學研究. 2011(03)
[2]植物組織特異性啟動子的研究進展[J]. 糜賽男,曹明富.  生物學教學. 2010(07)
[3]山羊乳腺特異性表達慢病毒載體的構建與驗證[J]. 樸慶林,于永生,羅曉彤,金海國.  安徽農業(yè)科學. 2009(31)
[4]紅球菌啟動子識別及β-半乳糖苷酶報告基因表達[J]. 劉昌春,于慧敏,馬玉超,潘雯宇,羅暉,沈忠耀.  生物工程學報. 2009(09)
[5]以β-半乳糖苷酶為報告基因的原核啟動子檢測體系構建[J]. 陳坤,黎明,樊欣迎,路福平.  生物技術. 2008(01)
[6]乙型肝炎病毒啟動子調控的增強型綠色熒光蛋白真核表達載體的構建與表達[J]. 謝娜,王曉燕,張瓊,林園園,林菊生.  中華肝臟病雜志. 2006(04)
[7]MyoD基因在不同豬種中的PCR-RFLP遺傳多態(tài)性及其遺傳效應研究[J]. 朱礪,李學偉.  畜牧獸醫(yī)學報. 2005(08)
[8]啟動子克隆方法研究進展[J]. 李姍姍,遲彥,李凌飛,馬璽,平文祥,于沖,周東坡.  中國生物工程雜志. 2005(07)
[9]無輔助病毒HSV-1載體介導LacZ基因在培養(yǎng)皮層神經(jīng)元中的表達[J]. 王漢森,潘虹,張玉稚,包新華,張國榮,吳希如.  北京大學學報(醫(yī)學版). 2005(02)
[10]二花臉豬與大約克豬生長期肌內脂肪合成與水解基因表達特征的比較研究[J]. 高勤學,李俊,劉紅林,王林云,徐銀學.  遺傳學報. 2004(11)

博士論文
[1]豬ADAMTS1基因的克隆、定位、表達規(guī)律、遺傳效應和調控機理的研究[D]. 樂凱.華中農業(yè)大學 2008
[2]豬肌肉生長相關轉錄因子的克隆、啟動子調控及遺傳效應分析[D]. 劉敏.華中農業(yè)大學 2007

碩士論文
[1]豬肌肉組織骨骼肌特異性基因α-actin啟動子的克隆及功能驗證[D]. 劉京鴿.華中農業(yè)大學 2010
[2]CMV與SP雙啟動子增強外源基因在小鼠骨骼肌組織中的表達效率[D]. 章倩倩.吉林大學 2007



本文編號：3102754