本文關(guān)鍵詞：五指山小型豬SLA單倍型分型及異種移植配型研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬主要組織相容性復(fù)合體又被稱為豬白細胞抗原(Swine Lymphocyte Antig en,SLA),由高度多態(tài)且緊密連鎖遺傳的基因簇組成,在抗原遞呈、免疫調(diào)節(jié)及疾病的抵抗等方面起重要的作用。研究表明,異種移植時SLA可作為移植抗原引起免疫排斥反應(yīng),以不同SLA單倍型豬為供體進行異種器官移植后,移植效果存在明顯差異。五指山小型豬是目前我國異種器官移植研究常用實驗動物之一,為明晰五指山小型豬SLA I類和II類基因的等位基因及單倍型分布情況,本研究利用分子克隆測序并結(jié)合PCR-SSP方法對35頭五指山小型豬SLA單倍型分型,同時在體外進行補體依賴的淋巴細胞毒試驗(Complement dependent cytotoxicity,C DC),分析不同單倍型個體與異種移植免疫排斥的關(guān)聯(lián)性,以期為異種器官移植研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。獲得的主要研究結(jié)果如下:1.五指山小型豬封閉群體中,SLA-1基因座的2條均為新發(fā)現(xiàn)的等位基因序列,將序列提交于GenBank和ISAG(International Society Animal Genetics),并獲取相應(yīng)的序列號及等位基因名稱:SLA-1*0401wz01(GenBank登錄號:KT715501),SLA-1*0703(GenBank登錄號:KT194212);SLA-2基因座的SLA-2*1102為已發(fā)現(xiàn)的等位基因,SLA-2*11wz01(GenBank登錄號:KT194213)為新發(fā)現(xiàn)的等位基因;SLA-3、SLA-DRB1和SLA-DQB1基因座的等位基因序列均已被報道,分別為SLA-3*0401、SLA-3*0403、SLA-DRB1*0901、SLA-DRB1*0401、SLA-DQB1*0901和SLA-DQB1*0501。2.本研究群體中新發(fā)現(xiàn)了3個SLAⅠ類和2個SLAⅡ類單倍型,被ISAG命名委員會依次命名為:Hp-75.00(SLA-1*0401wz01,SLA-3*0403,SLA-2*11wz01);H p-76b.00(SLA-1*0703,SLA-3*0401,SLA-2*11wz01);Hp-76a.00(SLA-1*0703,SLA-3*0401,SLA-2*1102);Hp-00.27(SLA-DRB1*0901,SLA-DQB1*0901);Hp-00.41(SLA-DRB1*0401,SLA-DQB1*0501)。3.根據(jù)五指山小型豬基礎(chǔ)群中獲得SLA基因等位基因的序列特征,共設(shè)計10對序列特異性引物并驗證其有效,利用PCR-SSP方法在DNA水平上對子代個體進行SLA分型,最終發(fā)現(xiàn)子代個體中存在基礎(chǔ)群體中的4種單倍型。4.將五指山小型豬獲得的10條SLA等位基因氨基酸序列分別與人CD4、CD8分子識別的HLA分子氨基酸序列及與HLAⅠ類基因KIR結(jié)合區(qū)重要氨基酸同源性比較發(fā)現(xiàn),五指山小型豬SLA分子與人HLA同源性較高,并且SLA-DRB1基因座上的等位基因序列與人CD4分子識別的HLA分子關(guān)鍵結(jié)合域氨基酸序列完全相同。5.本研究群體五指山小型豬血型為A型。雜合單倍型(Hp-75a.27/76a.41)個體和純合單倍型(Hp-76a.41/76a.41、Hp-75.27/75.27)個體PBMC分別與滅火的猴、人血清反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),人血清與不同單倍型PBMC反應(yīng)后,細胞死亡率差異顯著(P0.05),AB、BB型細胞死亡率明顯高于AA型。然而,猴血清與不同單倍型PBMC反應(yīng)后差異不顯著。本研究首次系統(tǒng)地完成了五指山小型豬SLA經(jīng)典Ⅰ類以及SLAⅡ類單倍型分型,并獲得Hp-76a.41、Hp-75.27兩種純合單倍型家系。體外初步研究發(fā)現(xiàn)異種移植免疫排斥的強弱與豬SLA單倍型的類型相關(guān)性較低,但經(jīng)人源化修飾的五指山小型豬PBMC與人或猴血清反應(yīng)后,細胞死亡率相對較低。因此,五指山小型豬可作為未來豬-人異種器官移植的良好供體之一。
【關(guān)鍵詞】：五指山小型豬 SLA 單倍型 異種移植 免疫排斥 血型
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 摘要4-6
• Summary6-11
• 第一章 文獻綜述11-25
• 1 異種器官移植免疫排斥概況11-13
• 2 SLA基因研究13-23
• 2.1 SLA簡介13
• 2.2 SLAⅠ類基因13-15
• 2.3 SLAⅡ類基因15-16
• 2.4 SLA III類基因16
• 2.5 SLA遺傳特征16-17
• 2.6 SLA生物學功能17-18
• 2.7 SLA分型方法及研究進展18-21
• 2.7.1 血清學分型18-19
• 2.7.2 細胞學分型19
• 2.7.3 分子生物學分型19-21
• 2.8 SLA等位基因及單倍型命名21-22
• 2.8.1 SLA等位基因命名21-22
• 2.8.2 SLA單倍型命名22
• 2.9 SLA單倍型與器官移植的關(guān)系22-23
• 3 異種器官移植配型研究23-24
• 3.1 血型配型23
• 3.2 MHC配型23-24
• 4 本研究的目的及意義24-25
• 第二章 五指山小型豬SLA單倍型分型25-48
• 1 材料與方法25-35
• 1.1 材料25
• 1.2 主要儀器設(shè)備25
• 1.3 主要試劑及配制25-26
• 1.4 試驗方法26-35
• 1.4.1試驗設(shè)計26-27
• 1.4.2 組織RNA的提取和檢測27-28
• 1.4.3 反轉(zhuǎn)錄RNA28-29
• 1.4.4 SLA基因的擴增29-30
• 1.4.5 PCR擴增產(chǎn)物回收30-31
• 1.4.6 連接與轉(zhuǎn)化31-32
• 1.4.7 單菌落陽性鑒定及測序32
• 1.4.8 序列分析32-33
• 1.4.9 PCR-SSP分型方法的建立33-35
• 2 結(jié)果與分析35-45
• 2.1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果35-36
• 2.2 目的基因的擴增結(jié)果36-37
• 2.3 菌液陽性鑒定結(jié)果37
• 2.4 DNA雙向測序結(jié)果37-38
• 2.5 五指山小型豬SLA等位基因及新發(fā)現(xiàn)的等位基因的命名結(jié)果38-39
• 2.6 同源性分析結(jié)果39-41
• 2.7 子代PCR-SSP檢測結(jié)果41-43
• 2.8 五指山小型豬檢測群體中等位基因的分布結(jié)果43-45
• 2.9 五指山小型豬檢測群體中單倍型分布結(jié)果45
• 3 討論45-47
• 3.1關(guān)于SLAⅠ類與Ⅱ類分子功能基因氨基酸序列與HLA同源性分析45-47
• 3.2 五指山小型豬檢測群體中單倍型分布47
• 4 小結(jié)47-48
• 第三章 異種移植配型研究48-55
• 1 材料與方法48-51
• 1.1 材料48
• 1.2 主要儀器設(shè)備48
• 1.3 主要試劑及配制48-49
• 1.4 試驗方法49-51
• 1.4.1 試驗設(shè)計49
• 1.4.2 GGTA1-/-五指山小型豬AO血型的檢測49
• 1.4.3 GGTA1-/-五指山小型豬外周血單核細胞的分離49-50
• 1.4.4 GGTA1基因表達檢測50
• 1.4.5 淋巴細胞毒配型實驗（CDC）50-51
• 2 結(jié)果51-53
• 2.1 GGTA1基因表達檢測結(jié)果51
• 2.2 CDC流式檢測結(jié)果51-52
• 2.3 統(tǒng)計分析結(jié)果52-53
• 3 討論53
• 4 小結(jié)53-55
• 第四章 全文總結(jié)55-56
• 致謝56-57
• 參考文獻57-65
• 作者簡介65-66
• 導師簡介66-67

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