發(fā)布時間：2021-03-17 19:49

　　外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)的表達既受到表達載體的啟動子影響,又受到外源基因在插入過程中所引起的插入位點效應(yīng)的影響。本實驗室采用原核顯微注射法制備了可以穩(wěn)定遺傳的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠。為了研究影響外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)表達的因素,本試驗將實驗室保留的F3代的MyoD和PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)世代純繁建系,檢測轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因在DNA、RNA和蛋白水平的表達;通過熱不對稱交錯式PCR（TAIL-PCR）法對轉(zhuǎn)基因鼠中的外源基因MyoD和PPAR-γ2進行定位,確定外源基因的插入位點,再分析外源基因整合過程中產(chǎn)生的插入位點效應(yīng),為日后應(yīng)用于生產(chǎn)實踐奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1、測定PPAR-γ2轉(zhuǎn)基因鼠和野生型鼠后腿肌肉組織中的甘油三酯含量和PPAR-γ蛋白的表達情況,檢測的結(jié)果表明PPAR-γ2陽性轉(zhuǎn)基因鼠肌內(nèi)甘油三酯的含量高于野生型鼠（p<0.05）,PPAR-γ蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠中的表達高于野生型鼠;2、用RT-qPCR法檢測MyoD轉(zhuǎn)基因鼠各組織中外源基因的表達量,結(jié)果表明外源基因MyoD在肌肉組織中的表達量高于其他組織,且后腿肌肉組織中MyoD蛋白的表達量My... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 引言
    2 轉(zhuǎn)基因動物建系
    3 外源基因定位的方法及研究進展
        3.1 熱不對稱交錯式PCR法
        3.2 反向PCR法
        3.3 熒光原位雜交法
        3.4 連接介導(dǎo)PCR法
    4 插入位點效應(yīng)的研究進展
        4.1 甲基化的檢測方法及研究進展
            4.1.1 限制性酶切PCR
            4.1.2 甲基化特異性PCR
            4.1.3 變性高效液相色譜法
            4.1.4 亞硫酸鹽測序PCR
            4.1.5 亞硫酸鹽PCR-SSCP
        4.2 拷貝數(shù)的檢測方法及研究進展
            4.2.1 絕對定量PCR法
            4.2.2 Southern Blot
            4.2.3 CGH芯片
            4.2.4 高密度SNP芯片
        4.3 其他插入位點效應(yīng)及研究進展
    5 研究的目的與意義
第二章 材料方法
    1 試驗材料
        1.1 試驗動物
        1.2 載體和質(zhì)粒
        1.3 主要儀器與設(shè)備
        1.4 主要試劑及試劑盒
        1.5 主要溶液的配制
    2 試驗方法
        2.1 后代陽性轉(zhuǎn)基因鼠的鑒定
            2.1.1 小鼠基因組DNA的提取
            2.1.2 陽性鼠的鑒定
        2.2 轉(zhuǎn)基因鼠基因組外源基因拷貝數(shù)的鑒定
            2.2.1 小鼠單拷貝基因重組質(zhì)粒的檢測
            2.2.2 PCR擴增產(chǎn)物的檢測
            2.2.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            2.2.4 陽性克隆的檢測及測序
            2.2.5 將連接目的片段的pGL3-Basic的重組質(zhì)粒小量提取
            2.2.6 轉(zhuǎn)基因鼠基因組內(nèi)拷貝數(shù)的鑒定
        2.3 轉(zhuǎn)基因鼠目的基因在RNA水平表達情況的驗證
            2.3.1 轉(zhuǎn)基因鼠不同組織RNA的提取
            2.3.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
            2.3.3 實時熒光定量PCR分析MyoD轉(zhuǎn)基因鼠不同組織中MyoD基因的表達情況
        2.4 轉(zhuǎn)基因鼠目的基因在蛋白水平表達情況的驗證
            2.4.1 轉(zhuǎn)基因鼠與野生型鼠肌肉組織蛋白的提取
            2.4.2 Western blot檢測目的蛋白質(zhì)的表達量
        2.5 轉(zhuǎn)基因鼠肌肉組織甘油三酯的測定
        2.6 外源基因定位
            2.6.1 熱不對稱交錯式PCR
            2.6.2 PCR擴增產(chǎn)物的檢測
            2.6.3 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.6.4 膠回收產(chǎn)物連接T載體
            2.6.5 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.6.6 陽性克隆的檢測及測序
        2.7 亞硫酸鹽PCR-SSCP
            2.7.1 外源基因CpG島分析
            2.7.2 基因組DNA亞硫酸鹽處理
            2.7.3 亞硫酸鹽處理產(chǎn)物PCR擴增
            2.7.4 PCR擴增產(chǎn)物的檢測
            2.7.5 PCR產(chǎn)物的回收及純化
            2.7.6 膠回收產(chǎn)物連接T載體
            2.7.7 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.7.8 陽性克隆的檢測及測序
            2.7.9 測序結(jié)果SSCP檢測
        2.8 統(tǒng)計學(xué)分析
第三章 研究結(jié)果與分析
    1 PPAR-γ2 陽性轉(zhuǎn)基因鼠的檢測
    2 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因穩(wěn)定遺傳的判定
    3 肌肉組織中外源基因PPAR-γ2 的表達情況
    4 肌肉組織內(nèi)甘油三酯的測定
    5 TAIL-PCR定位外源基因PPAR-γ2 的結(jié)果
    6 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因存在的插入位點效應(yīng)
        6.1 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因拷貝數(shù)的判定
        6.2 PPAR-γ2 轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因其他的插入位點效應(yīng)
    7 MyoD陽性轉(zhuǎn)基因鼠的檢測
    8 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因穩(wěn)定遺傳的判定
    9 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因MyoD的表達情況
        9.1 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因MyoD的組織表達譜分析
        9.2 肌肉組織中外源基因MyoD的表達情況
    10 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因存在的插入位點效應(yīng)
        10.1 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠外源基因拷貝數(shù)的判定
        10.2 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠中外源基因啟動子區(qū)域的CpG島甲基化的鑒定
        10.3 MyoD轉(zhuǎn)基因鼠外源基因其他插入位點效應(yīng)的鑒定
第五章 討論
第六章 結(jié)論
    1 本試驗取得的結(jié)果
    2 后期研究設(shè)想
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3087623