CRISPR/Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)的構(gòu)建及其在豬基因組編輯中的應(yīng)用研究
發(fā)布時間：2021-03-09 03:59
基因組編輯是借助于細胞自身的DNA損傷修復(fù)機制對目標(biāo)基因序列進行堿基刪除、插入或突變的基因組操作過程。早期僅依靠自發(fā)性同源重組的基因組編輯效率極低,直到人工核酸酶出現(xiàn),由人工核酸酶定點切割DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂,激活體內(nèi)DNA修復(fù)機制進行定點的基因組編輯,極大的提高了編輯的效率。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,一些基因得到注釋,基因功能的研究成為重點和熱點,目前研究基因功能的手段主要是基因修飾技術(shù)。近年來,CRISPR/Cas9核酸酶以其簡單、快捷、高效的特點迅速發(fā)展,廣泛運用于不同種類細胞的基因組修飾。精準(zhǔn)的定點基因組編輯技術(shù)不僅能推進基因功能的研究,用于構(gòu)建人類疾病模型、基因治療,還能加快動物的遺傳改良。雙等位基因基因組修飾細胞的獲得費時、費力且效率很低,目前這仍然是基因組編輯技術(shù)中的一個難點。本研究開發(fā)了一套CRISPR/Cas9高效等位基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)有效整合了基因編輯陽性細胞富集報告系統(tǒng)（Surrogate Reporter,Rep）與含有sgRNA的供體系統(tǒng)（Donor,Don）。其特點是既能作為供體提供修復(fù)的模板,又能作為報告系統(tǒng)反應(yīng)核酸酶的活性和靶位點整合的效率。首先在哺乳動物...
【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：131 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
DNA雙鏈斷裂修復(fù)機制(Chugunovaetal.,2016)
鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)是一種由鋅指模塊和FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白(Kim et al., 1996)。單獨的核酸酶結(jié)構(gòu)域缺乏DNA識別特異性，只能依靠融合的鋅指蛋白來特異識別DNA序列（圖1-2）。鋅指是普遍存在于轉(zhuǎn)錄因子中小的天然的DNA結(jié)構(gòu)域，一個鋅指可以識別三個堿基，鋅指的這種相應(yīng)的DNA識別簡單規(guī)則和可使用幾個連續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)域識別連續(xù)的DNA序列允許研究者組裝出基于鋅指的人工DNA結(jié)合模塊。由可設(shè)計的DNA結(jié)合位點和忠誠的核酸酶酶切部分組成了第一代可以直接用于基因組編輯的工具(Chugunova et al., 2016)。ⅡS型限制性內(nèi)切酶，比如來源于海床黃桿菌的FokI，能識別短的DNA序列且在識別位點的一定間距切割DNA引起雙鏈斷裂。這種特性是因為這些蛋白的DNA結(jié)合位點和核酸酶結(jié)構(gòu)域是分開的能獨立行使功能的(Li et al., 1992)。核酸酶結(jié)構(gòu)域沒有明顯的序列特異性，DNA斷裂的位點可以通過改變DNA結(jié)合域的特異性而改變(Kim and Chandrasegaran, 1994)。Cys2-His2家族是最適合用于組合定點核酸酶的鋅指，每一個鋅指是很小的，大約有30個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)是包含了一個α螺旋和兩個β折疊的αββ結(jié)構(gòu)。鋅指核酸內(nèi)切酶的一個特點是FokI需要形成二聚體才具有切割DNA雙鏈的酶活性(Smith et al., 2000)，因此必需把兩個鋅指蛋白分別與FokI相結(jié)合
2013; Forsyth et al., 2016; Lee et al., 2015; T. Li et al., 2016; Nakade et al., 201o et al., 2015; Sun et al., 2012; Watanabe et al., 2014; Zu et al., 2013)。雖然TALE蛋蛋白大小類似，但卻從識別三個堿基變成了識別一個堿基，這就使最終構(gòu)建成更大，轉(zhuǎn)染進入細胞的難度也是一個問題。和其它核酸酶一樣，TALEN可以在似靶序列的地方造成脫靶的情況，不過可以通過選擇不同于基因組上其它位點點（至少需要7個核苷酸）來解決這個問題。相對于ZFN，TALEN的構(gòu)建更容易，TALEN只要簡單的分子克隆技術(shù)就能完不需要耗費大量的時間。在靶位點識別上TALEN的選擇范圍更廣泛，識別特異的能力更強，特異性更好，靶效率較高。但是，TALEN技術(shù)與ZFN一樣，識別的都是蛋白質(zhì)，一個TAL模塊34個氨基酸才能識別一個堿基，所以構(gòu)建一個識A特異序列的TALEN蛋白，有可能需要構(gòu)建一個成百上千氨基酸的TALEN蛋白裝上耗時外，還有可能引起細胞體內(nèi)的免疫反應(yīng)而降低編輯效率。在TALEN開代ZFNs人工核酸酶而引領(lǐng)一個新時代得到廣泛的運用前，基于RNA介導(dǎo)的核CRISPR/Cas系統(tǒng)出現(xiàn)了，這項新技術(shù)直接取代TALEN成為基因組編輯新時代
本文編號：3072209
【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：131 頁
【學(xué)位級別】：博士
【部分圖文】：
DNA雙鏈斷裂修復(fù)機制(Chugunovaetal.,2016)
鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFN)是一種由鋅指模塊和FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域組成的嵌合蛋白(Kim et al., 1996)。單獨的核酸酶結(jié)構(gòu)域缺乏DNA識別特異性，只能依靠融合的鋅指蛋白來特異識別DNA序列（圖1-2）。鋅指是普遍存在于轉(zhuǎn)錄因子中小的天然的DNA結(jié)構(gòu)域，一個鋅指可以識別三個堿基，鋅指的這種相應(yīng)的DNA識別簡單規(guī)則和可使用幾個連續(xù)的蛋白結(jié)構(gòu)域識別連續(xù)的DNA序列允許研究者組裝出基于鋅指的人工DNA結(jié)合模塊。由可設(shè)計的DNA結(jié)合位點和忠誠的核酸酶酶切部分組成了第一代可以直接用于基因組編輯的工具(Chugunova et al., 2016)。ⅡS型限制性內(nèi)切酶，比如來源于海床黃桿菌的FokI，能識別短的DNA序列且在識別位點的一定間距切割DNA引起雙鏈斷裂。這種特性是因為這些蛋白的DNA結(jié)合位點和核酸酶結(jié)構(gòu)域是分開的能獨立行使功能的(Li et al., 1992)。核酸酶結(jié)構(gòu)域沒有明顯的序列特異性，DNA斷裂的位點可以通過改變DNA結(jié)合域的特異性而改變(Kim and Chandrasegaran, 1994)。Cys2-His2家族是最適合用于組合定點核酸酶的鋅指，每一個鋅指是很小的，大約有30個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)是包含了一個α螺旋和兩個β折疊的αββ結(jié)構(gòu)。鋅指核酸內(nèi)切酶的一個特點是FokI需要形成二聚體才具有切割DNA雙鏈的酶活性(Smith et al., 2000)，因此必需把兩個鋅指蛋白分別與FokI相結(jié)合
2013; Forsyth et al., 2016; Lee et al., 2015; T. Li et al., 2016; Nakade et al., 201o et al., 2015; Sun et al., 2012; Watanabe et al., 2014; Zu et al., 2013)。雖然TALE蛋蛋白大小類似，但卻從識別三個堿基變成了識別一個堿基，這就使最終構(gòu)建成更大，轉(zhuǎn)染進入細胞的難度也是一個問題。和其它核酸酶一樣，TALEN可以在似靶序列的地方造成脫靶的情況，不過可以通過選擇不同于基因組上其它位點點（至少需要7個核苷酸）來解決這個問題。相對于ZFN，TALEN的構(gòu)建更容易，TALEN只要簡單的分子克隆技術(shù)就能完不需要耗費大量的時間。在靶位點識別上TALEN的選擇范圍更廣泛，識別特異的能力更強，特異性更好，靶效率較高。但是，TALEN技術(shù)與ZFN一樣，識別的都是蛋白質(zhì)，一個TAL模塊34個氨基酸才能識別一個堿基，所以構(gòu)建一個識A特異序列的TALEN蛋白，有可能需要構(gòu)建一個成百上千氨基酸的TALEN蛋白裝上耗時外，還有可能引起細胞體內(nèi)的免疫反應(yīng)而降低編輯效率。在TALEN開代ZFNs人工核酸酶而引領(lǐng)一個新時代得到廣泛的運用前，基于RNA介導(dǎo)的核CRISPR/Cas系統(tǒng)出現(xiàn)了，這項新技術(shù)直接取代TALEN成為基因組編輯新時代
本文編號：3072209
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