新孢子蟲AMA1與RON2蛋白互作的鑒定及其免疫保護性研究
發(fā)布時間：2021-03-09 03:34
犬新孢子蟲（Neospora caninum,N.caninum）是一種胞內(nèi)寄生性原蟲,屬于頂復門原蟲。新孢子蟲病呈全球性分布,給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,世界范圍內(nèi)針對新孢子蟲病尚無特效藥物或疫苗。新孢子蟲入侵宿主細胞是蟲體突破機體防線的關(guān)鍵節(jié)點,其入侵過程主要為識別并黏附宿主細胞形成滑動連接體MJ侵入細胞后定殖。入侵過程取決于多種蛋白質(zhì)在寄生蟲和宿主細胞之間的相互作用,因此,研究新孢子蟲入侵機理有助于發(fā)現(xiàn)與入侵相關(guān)的基因和宿主靶標。近年來的研究表明弓形蟲RON2/4/5/8與頂膜抗原-1（AMA1）組成的復合體是MJ的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),新孢子蟲頂膜抗原-1可與多種蛋白相互作用,但同RON2之間是否存在相互作用還尚未得到證實。因此本研究擬利用GST-Pull down和雙分子熒光互補技術(shù)確定新孢子蟲AMA1與RON2之間是否存在相互作用,利用免疫熒光技術(shù)（IFA）對新孢子蟲AMA1與RON2進行亞細胞定位,并進行新孢子蟲AMA1與RON2蛋白對小鼠和山羊的免疫保護性研究,為新型抗新孢子蟲藥物及疫苗靶標的開發(fā)提供參考。Nc AMA1與Nc RON2互作的GST-Pull down鑒定:GST-...
【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
【文章頁數(shù)】：81 頁
【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖
第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定25圖1.2含His標簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白表達與純化電泳圖（A）蛋白表達產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pET-28a-NcAMA1載體蛋白Fig1.2ExpressionandpurificationelectrophoresisofpET-28a-NcAMA1vectorproteinwithHistag（A）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpET-28a-NcAMA1carrierprotein2.1.3含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達及純化將上述已經(jīng)成功構(gòu)建好并且已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中的含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體用IPTG進行誘導表達，將表達后得到的菌液進行離心超聲儀超聲的得到的上清作為樣品，然后經(jīng)過蛋白電泳后發(fā)現(xiàn)蛋白表達的大小約為33kDa，且表達的蛋白為可溶性蛋白（圖1.3A）；將蛋白進行純化，再次進行蛋白電泳可發(fā)現(xiàn)得到一個具有單一條帶的目的蛋白大小為33kDa且未發(fā)現(xiàn)有明顯的雜帶（圖1.3B），說明含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白純化效果較好，進行后續(xù)步驟。
第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定26圖1.3含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達與純化電泳圖（A）蛋白表達產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白Fig1.3ExpressionandpurificationelectrophoresisofpGEX-4T-NcRON2vectorproteinwithHistag（B）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpGEX-4T-NcRON2carrierprotein2.1.4GST-Pulldown試驗將純化后含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白和GST標簽蛋白分別加入到GST蛋白純化填料中，使其孵育后結(jié)合，之后將含His標簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白分別等量加入到前面處理后的GST蛋白純化填料中，完成GST-Pulldown試驗。完成試驗后使用WB試驗對得到的洗脫液進行分析。結(jié)果：pGEX-4T-NcRON2載體蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中可以發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標簽的條帶，GST標簽蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標簽的條帶（圖1.4），證明了新孢子蟲NcAMA1
本文編號：3072175
【文章來源】：吉林大學吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校
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【學位級別】：碩士
【部分圖文】：
重組質(zhì)粒雙酶切鑒定電泳圖
第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定25圖1.2含His標簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白表達與純化電泳圖（A）蛋白表達產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pET-28a-NcAMA1載體蛋白Fig1.2ExpressionandpurificationelectrophoresisofpET-28a-NcAMA1vectorproteinwithHistag（A）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpET-28a-NcAMA1carrierprotein2.1.3含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達及純化將上述已經(jīng)成功構(gòu)建好并且已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)中的含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體用IPTG進行誘導表達，將表達后得到的菌液進行離心超聲儀超聲的得到的上清作為樣品，然后經(jīng)過蛋白電泳后發(fā)現(xiàn)蛋白表達的大小約為33kDa，且表達的蛋白為可溶性蛋白（圖1.3A）；將蛋白進行純化，再次進行蛋白電泳可發(fā)現(xiàn)得到一個具有單一條帶的目的蛋白大小為33kDa且未發(fā)現(xiàn)有明顯的雜帶（圖1.3B），說明含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白純化效果較好，進行后續(xù)步驟。
第二篇研究內(nèi)容第一章新孢子蟲NcAMA1與NcRON2相互作用的鑒定26圖1.3含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白表達與純化電泳圖（A）蛋白表達產(chǎn)物；（B）蛋白純化產(chǎn)物；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：菌體超聲上清液；2：純化的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白Fig1.3ExpressionandpurificationelectrophoresisofpGEX-4T-NcRON2vectorproteinwithHistag（B）Proteinexpressionproduct；（B）Proteinpurificationproducts；M：ProteinMarker(14-100kDa）；1：Supernatantoftheexpressionproduct；2：PurifiedpGEX-4T-NcRON2carrierprotein2.1.4GST-Pulldown試驗將純化后含GST標簽的pGEX-4T-NcRON2載體蛋白和GST標簽蛋白分別加入到GST蛋白純化填料中，使其孵育后結(jié)合，之后將含His標簽的pET-28a-NcAMA1載體蛋白分別等量加入到前面處理后的GST蛋白純化填料中，完成GST-Pulldown試驗。完成試驗后使用WB試驗對得到的洗脫液進行分析。結(jié)果：pGEX-4T-NcRON2載體蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中可以發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標簽的條帶，GST標簽蛋白與pET-28a-NcAMA1載體蛋白共孵育得到的洗脫液中沒有發(fā)現(xiàn)存在pET-28a-NcAMA1載體蛋白含His標簽的條帶（圖1.4），證明了新孢子蟲NcAMA1
本文編號：3072175
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