新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）是一種與養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)息息相關(guān)的重要禽類病毒，由其引起的新城疫（Newcastle disease，ND）具有高度的傳染性和致死性，嚴(yán)重威脅了世界養(yǎng)禽業(yè)的正常發(fā)展。新城疫病毒屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），基因組為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，其基因組按照3′-Leader-NP-P-M-F-HN-L-Trailer5′的順序編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白。NDV病毒蛋白的翻譯依賴于宿主的翻譯系統(tǒng)，其mRNA與大多數(shù)真核生物一樣都具有5＇帽子結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為L(zhǎng)蛋白具有加帽酶的活性能夠在病毒mRNA的5＇端形成缺少2’-O甲基化的“cap0”型帽子結(jié)構(gòu)。新城疫病毒在細(xì)胞內(nèi)具有很強(qiáng)的增殖能力，感染后能夠迅速、大量地合成病毒自身RNA和蛋白，完成裝配。新城疫病毒RNA的合成是依賴其自身合成的病毒RNA聚合酶，啟動(dòng)病毒的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，但是轉(zhuǎn)錄后的翻譯機(jī)制尚未可知。大多數(shù)真核生物的mRNA都具有3’ poly A尾和5’甲基化的帽子結(jié)構(gòu)，并利用帽子結(jié)構(gòu)依賴性的真核翻譯系統(tǒng)進(jìn)行mRNA的翻譯。翻譯的起... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：112 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
圖表目錄
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 新城疫病毒概述
    1.2 真核翻譯起始研究進(jìn)展
        1.2.1 真核翻譯起始概述
        1.2.2 真核生物帽子結(jié)構(gòu)的分類
        1.2.3 翻譯起始復(fù)合體 eIF4F
        1.2.4 翻譯起始復(fù)合體 eIF4F 功能的調(diào)控機(jī)制
            1.2.4.1 PI3K/Akt/mTOR 通路對(duì) eIF4F 功能的調(diào)控
            1.2.4.2 促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信號(hào)通路對(duì) eIF4E 磷酸化水平的調(diào)節(jié)
    1.3 病毒“劫持”真核翻譯系統(tǒng)的研究進(jìn)展
        1.3.1 抑制宿主 mRNA 的翻譯
            1.3.1.1 病毒對(duì)真核翻譯起始因子的直接調(diào)節(jié)作用
            1.3.1.2 病毒對(duì)真核翻譯起始因子的間接調(diào)節(jié)作用
            1.3.1.3 病毒通過對(duì) RNA 的調(diào)節(jié)來控制蛋白質(zhì)翻譯
        1.3.2 帽子結(jié)構(gòu)非依賴性（cap-independent）翻譯機(jī)制
            1.3.2.1 在 mRNA 的 5’端偶聯(lián)病毒蛋白
            1.3.2.2 IRES-依賴性的翻譯機(jī)制
        1.3.3 病毒對(duì)宿主帽子結(jié)構(gòu)依賴性（cap-dependent）蛋白翻譯的調(diào)節(jié)作用
            1.3.3.1 DNA 病毒對(duì)帽子結(jié)構(gòu)依賴性（cap-dependent）蛋白翻譯的調(diào)控
            1.3.3.2 RNA 病毒對(duì)帽子結(jié)構(gòu)依賴性（cap-dependent）蛋白翻譯的調(diào)控
        1.3.4 eIF2α在調(diào)控蛋白翻譯和抗病毒免疫方面的作用
            1.3.4.1 病毒對(duì) eIF2α磷酸化的抑制作用
            1.3.4.2 病毒采用不依賴于 eIF2 的翻譯機(jī)制逃避 eIF2α磷酸化所產(chǎn)生的抑制作用
        1.3.5 病毒調(diào)控宿主翻譯系統(tǒng)研究展望
    1.4 本研究的目的及意義
第二章 新城疫病毒 NP 蛋白的原核表達(dá)及單克隆抗體的制備
    摘要
    2.1 材料和方法
        2.1.1 病毒
        2.1.2 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用
        2.1.3 原核表達(dá)載體和主要試劑
        2.1.4 主要緩沖液及試劑的配制
        2.1.5 DUCK/JS/10 弱毒株 NP 蛋白的克隆與原核表達(dá)
        2.1.6 重組 NP 蛋白的原核表達(dá)及純化
        2.1.7 動(dòng)物免疫及間接 ELISA 檢測(cè)方法的建立
        2.1.8 單克隆抗體的制備
        2.1.9 單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)
            2.1.9.1 間接 ELISA 檢測(cè)
            2.1.9.2 間接免疫熒光鑒定
            2.1.9.3 Western Blot 檢測(cè)
        2.1.10 NP 單克隆抗體與不同毒株反應(yīng)性檢測(cè)
    2.2 結(jié)果
        2.2.1 NP 基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
        2.2.2 pET-32a-NP 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
        2.2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立及腹水抗體效價(jià)測(cè)定
        2.2.4 NP 單克隆抗體的間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)
        2.2.5 NP 單克隆抗體的 Western Blot 檢測(cè)
        2.2.6 NP 單克隆抗體與不同 NDV 毒株反應(yīng)性檢測(cè)
    2.3 討論
第三章 新城疫病毒依賴宿主真核翻譯系統(tǒng)進(jìn)行病毒蛋白合成
    摘要
    3.1 材料和方法
        3.1.1 病毒和細(xì)胞系
        3.1.2 抗體及主要試劑
        3.1.3 主要緩沖液及試劑配制
        3.1.4 Western-blot 檢測(cè) NDV 感染后 eIF4F 各組分的磷酸化水平變化
        3.1.5 紫外滅活新城疫病毒誘導(dǎo) eIF4F 磷酸化檢測(cè)
        3.1.6 m7GTP pull down 檢測(cè) NDV 感染后 eIF4F 復(fù)合體的裝配活性變化
        3.1.7 間接免疫熒光（IFA）觀察 NP 蛋白與 eIF4E 共定位
        3.1.8 eIF4E 和/或 eIF4G 的干擾對(duì) NDV 復(fù)制的影響
    3.2 結(jié)果
        3.2.1 新城疫病毒感染后誘導(dǎo) eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
        3.2.2 紫外滅活的新城疫病毒不誘導(dǎo) eIF4E 和 eIF4G 的磷酸化
        3.2.3 新城疫病毒感染能夠誘導(dǎo) eIF4F 復(fù)合體的裝配
        3.2.4 新城疫病毒感染能夠誘導(dǎo) eIF4E 發(fā)生亞細(xì)胞定位變化
        3.2.5 eIF4E 和/或 eIF4G 的缺失能夠影響新城疫病毒蛋白的合成
    3.3 討論
第四章 PI3K/AKT 通路在 NDV 激活 EIF4F 過程中的調(diào)控作用
    摘要
    4.1 材料和方法
        4.1.1 病毒和細(xì)胞系
        4.1.2 抗體及主要試劑
        4.1.3 主要緩沖液及試劑配制
        4.1.4 NDV 感染后 PI3K/Akt 通路及下游信號(hào)分子的磷酸化檢測(cè)
        4.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法篩選最適抑制劑工作濃度
        4.1.6 抑制劑阻斷 PI3K/Akt/mTOR 通路后下游信號(hào)分子磷酸化水平檢測(cè)
        4.1.7 抑制劑阻斷 PI3K/Akt/mTOR 通路后對(duì) eIF4F 復(fù)合體裝配的影響
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 新城疫感染誘導(dǎo) PI3K/Akt 通路及下游信號(hào)分子的活化
        4.2.2 新城疫感染可誘導(dǎo) 4E-BP1 發(fā)生過磷酸化
        4.2.3 最適抑制劑工作濃度的確定
        4.2.4 PI3K 參與介導(dǎo) NDV 感染所誘導(dǎo)的 Akt 及下游信號(hào)分子的磷酸化
        4.2.5 mTOR 激酶介導(dǎo) NDV 感染所引起的 eIF4G 磷酸化
        4.2.6 NDV 誘導(dǎo)的 4E-BP1 過磷酸化能夠拮抗 Rapamycin 的抑制作用
        4.2.7 NDV 感染后通過激活 PI3K/Akt 通路誘導(dǎo) eIF4F 復(fù)合體的形成
        4.2.8 LY294002 對(duì)新城疫病毒復(fù)制的影響
        4.2.9 Rapamycin 不抑制 NDV 感染所誘導(dǎo)的 eIF4F 復(fù)合體的形成
        4.2.10 Rapamycin 對(duì)新城疫病毒復(fù)制的影響
    4.3 討論
第五章 MAPK 信號(hào)通路在 NDV 激活 EIF4F 過程中的調(diào)控作用
    摘要
    5.1 材料和方法
        5.1.1 病毒和細(xì)胞系
        5.1.2 抗體及主要試劑
        5.1.3 主要緩沖液及試劑配制
        5.1.4 NDV 感染后 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 激酶的磷酸化檢測(cè)
        5.1.5 超氧化物歧化酶（WST-1）法篩選最適抑制劑工作濃度
        5.1.6 抑制劑阻斷 p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 后下游信號(hào)分子磷酸化檢測(cè)
        5.1.7 抑制劑阻斷 p38MAPK/Mnk1 通路后對(duì) eIF4F 復(fù)合體裝配的影響
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 新城疫感染誘導(dǎo) p38、Erk1/2 及下游 Mnk1 的活化
        5.2.2 最適抑制劑工作濃度的確定
        5.2.3 NDV 感染通過激活 Mnk1 誘導(dǎo) eIF4E 發(fā)生磷酸化
        5.2.4 Erk1/2 不介導(dǎo)新城疫病毒感染所引起的 eIF4E 的磷酸化
        5.2.5 p38MAPK 介導(dǎo) NDV 感染誘導(dǎo)的 Mnk1 以及下游 eIF4E 的磷酸化
        5.2.6 NDV 感染不通過激活 Mnk1 激酶誘導(dǎo) 4E-BP1 的過磷酸化
        5.2.7 NDV 感染不通過激活 MAPK 信號(hào)通路誘導(dǎo) 4E-BP1 的過磷酸化
        5.2.8 MAPK 通路不介導(dǎo) NDV 誘導(dǎo)的 eIF4F 復(fù)合體形成
        5.2.9 MAPK 通路對(duì)新城疫病毒復(fù)制的影響
    5.3 討論
第六章 新城疫病毒 NP 蛋白與 EIF4F 復(fù)合體相互作用
    摘要
    6.1 材料和方法
        6.1.1 病毒和細(xì)胞系
        6.1.2 抗體和質(zhì)粒
        6.1.3 主要試劑
        6.1.4 主要緩沖液及試劑配制
        6.1.5 NP 相關(guān)真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.1.6 FLAG-NP 及各突變體的表達(dá)及 Western-Blot 檢測(cè)
        6.1.7 m7GTP pull down 檢測(cè)病毒蛋白與 eIF4F 復(fù)合體的互作
        6.1.8 新城疫 NP 蛋白與 eIF4F 復(fù)合體的免疫共沉淀（Co-IP）
    6.2 結(jié)果
        6.2.1 m7GTP pull down 顯示 NP 蛋白可能與 eIF4F 復(fù)合體存在相互作用
        6.2.2 NDV 感染后 NP 蛋白與 eIF4F 復(fù)合體的免疫共沉淀
        6.2.3 NP 蛋白與 eIF4F 復(fù)合體的相互作用不需要其他病毒蛋白輔助
        6.2.4 FLAG-NP mutant 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        6.2.5 FLAG-NP 各突變體的真核表達(dá)及 Western-Blot 檢測(cè)
        6.2.6 新城疫病毒 NP 蛋白與 eIF4F 復(fù)合體互作結(jié)構(gòu)域分析
    6.3 討論
第七章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3072213