利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300的srtA基因缺失株及回補(bǔ)株,分析其對(duì)菌株毒力的影響。設(shè)計(jì)3對(duì)srtA基因sgRNA,以pCasSA為載體,構(gòu)建pCasSA-sgRNA質(zhì)粒。經(jīng)缺陷型金黃色葡萄球菌RN4220菌株修飾后,轉(zhuǎn)入U(xiǎn)SA300中,檢測(cè)pCasSA-sgRNA質(zhì)粒的切割效率。擴(kuò)增并融合srtA基因左右同源臂并將其插入pCasSA-sgRNA質(zhì)粒中,構(gòu)建敲除質(zhì)粒pCasSA-sgRNA-srtA。敲除質(zhì)粒經(jīng)修飾,轉(zhuǎn)入U(xiǎn)SA300中,篩選并鑒定獲得srtA基因缺失株。比較分析srtA基因缺失后對(duì)USA300菌株生長(zhǎng),小鼠存活率、器官載菌量及其腎臟組織病理學(xué)變化差異。同時(shí),以pLI50質(zhì)粒為載體,構(gòu)建回補(bǔ)質(zhì)粒pLI50-srtA及回補(bǔ)株,驗(yàn)證不同菌株表型是否存在差異。經(jīng)氯霉素篩選,獲得2個(gè)基因缺失株。與野生型菌株相比,srtA基因缺失后不影響USA300菌株的生長(zhǎng),但顯著降低感染小鼠的死亡率,心臟、腎臟載菌量及腎臟組織病變程度。經(jīng)srtA基因回補(bǔ)后其功能得以恢復(fù)。成功建立耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300菌株srtA基因缺失株和回補(bǔ)株基因編輯方... 

【文章來源】：生物技術(shù)通報(bào). 2020,36(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

pCasSA-sgRNA質(zhì)粒切割效率檢測(cè)

質(zhì)粒pCasSA為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌溫度敏感性質(zhì)粒,用于金黃色葡萄球菌的基因編輯(圖譜見圖1)。該質(zhì)�？梢岳肂sa I位點(diǎn)插入sgRNA片段,靶向目標(biāo)基因,利用Xho I和Xba I位點(diǎn)插入目標(biāo)基因左右同源臂序列,進(jìn)行同源修復(fù),進(jìn)而達(dá)到金黃色葡萄球菌基因敲除的目的。構(gòu)建pCasSA-sgRNA質(zhì)粒。使用限制性內(nèi)切酶Bsa I對(duì)pCasSA質(zhì)粒上的Bsa I位點(diǎn)進(jìn)行特異性酶切,酶切體系為:pCasSA 30 μL、Bsa I 2 μL、10×NEBuffer 5 μL、ddH2O 13 μL。使用天根生化科技(北京)有限公司DNA純化回收試劑盒進(jìn)行酶切質(zhì)粒的純化回收。酶切回收的pCasSA質(zhì)粒與退火后的雙鏈sgRNA序列經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接3 h。連接體系為:T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Ligase buffer 2 μL、退火后的雙鏈sgRNA序列12 μL,酶切回收后的pCasSA質(zhì)粒1 μL、ddH2O 4 μL。連接產(chǎn)物經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10中。用50 mg/μL的卡那霉素篩選陽性克隆,30℃增菌后用,用sgRNA上游序列(sgRNA1-F,sgRNA2-F,sgRNA3-F)和sgRNA檢測(cè)下游引物srtA-sgRNA-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將獲得的PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),陽性pCasSA-sgRNA質(zhì)粒(pCasSA-sgRNA1,pCasSA-sgRNA2,pCasSA-sgRNA3)送公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用MegAlign軟件進(jìn)行分析比對(duì)。

小鼠經(jīng)尾靜脈接種2×108 CFU/mL的金黃色葡萄球菌后,對(duì)小鼠的生存率進(jìn)行分析,結(jié)果如圖9所示。WT USA300顯著的引起了小鼠的死亡。srtA缺失后小鼠無死亡。srtA基因回補(bǔ)后,感染小鼠與WT USA300組的小鼠死亡情況基本一致,證明srtA基因回補(bǔ)后其功能基本恢復(fù)。2.9 金黃色葡萄球菌USA300 srtA基因缺失對(duì)器官組織內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的影響


本文編號(hào)：3066099