本文關(guān)鍵詞：西藏藏豬耐低氧基因ECE1的分子克隆及其表達分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：高原地區(qū)的低氣壓和低氧分壓嚴(yán)重影響著人類和動物的生存與發(fā)展。高原無論在政治經(jīng)濟以及軍事等很多方面都具有很重耍的意義,而且研究高原低氧反應(yīng)和低氧適應(yīng)的機理一直以來是受到生物學(xué)及醫(yī)學(xué)關(guān)注的重要領(lǐng)域。低氧適應(yīng)是一個復(fù)雜的性狀,它受多種因素的影響。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶1(Endothelin converting enzyme 1,ECE1)是近期發(fā)現(xiàn)的與耐低氧有關(guān)的重要候選基因,屬于內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶家族中的一員,是內(nèi)皮素-1(ET-1)生物合成過程中的關(guān)鍵限速酶,但是其cDNA序列還沒有獲得。為了進一步了解和認(rèn)識ECE1基因的結(jié)構(gòu)和功能,揭示ECE1對藏豬耐低氧能力的影響,尋找與低氧相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。本研究采用RACE技術(shù),獲得了藏豬ECE1基因的完整cDNA序列,并進行了克隆測序,采用生物信息學(xué)技術(shù),分析并預(yù)測了基因的結(jié)構(gòu)和功能。用qPCR和Western Blot技術(shù),對比檢測了ECE1基因在藏豬、萊蕪豬、大白豬不同品種豬的組織差異表達。主要研究結(jié)果如下:1.ECE1基因cDNA序列全長3771 bp(Gen Bank登錄號:KP411748),包含2 bp的5′UTR和1507bp的3′UTR序列。全部CDS序列2262 bp,編碼753個氨基酸,分子量為85.449kDa,等電點p I為5.49。ECE1基因編碼的氨基酸序列中,存在10個N-糖基化位點和45個磷酸化位點。二級結(jié)構(gòu)中大部分為α螺旋,屬于跨膜蛋白。在進化過程中高度保守,與牛、人和家鼠的氨基酸序列同源性分別為97%、96%和96%�；诘鞍仔蛄兴鶚�(gòu)建的分子進化樹,表明豬ECE1蛋白與駱駝的親緣關(guān)系最近。2.運用DNAMAN軟件對藏豬、萊蕪豬和大白豬的ECE1基因序列進行了對比分析,獲得9個基因突變位點,其中一個為非同義突變,在1055位點,導(dǎo)致了氨基酸序列351位置的纈氨酸變成了異亮氨酸。通過三級結(jié)構(gòu)預(yù)測,藏豬與平原豬相比,其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。3.在mRNA水平上,ECE1是一個廣譜表達基因,在肌肉、肝臟、背膘脂肪、肺臟、腎臟、心臟、脾臟、胰臟、胃和大腦中都能檢測到,且在心和胰臟之間存在明顯的組織表達差異(P0.05),其在心和肺中表達量較高,在胃和胰臟中表達量較低。在心、肺和肝臟三種組織中ECE1基因mRNA的表達量存在明顯的品種差異(P0.05);并且ECE1基因mRNA的表達量在三個豬種中始終是肝臟肺臟心臟肌肉背膘脂肪。在蛋白水平上,三個豬種的ECE1表達水平與定量檢測結(jié)果具有一致性。ECE1在心臟和肺臟組織中的高表達,說明心肺功能是影響藏豬耐低氧性狀的重要因素。
【關(guān)鍵詞】：西藏藏豬 ECE1 耐低氧性狀 基因克隆 表達對比分析
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S828
【目錄】：

• 英文縮略詞表4-7
• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 1 引言11-16
• 1.1 西藏藏豬與低氧適應(yīng)11-13
• 1.1.1 西藏藏豬11-12
• 1.1.2 低氧適應(yīng)12-13
• 1.2 內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶 1（ECE1）13-14
• 1.2.1 內(nèi)皮素13-14
• 1.2.2 ECE1基因的研究進展14
• 1.3 cDNA末端快速擴增技術(shù)14-15
• 1.4 本研究的目的和意義15-16
• 2 材料與方法16-38
• 2.1 試驗材料16-21
• 2.1.1 試驗動物與樣品采集16
• 2.1.2 主要儀器設(shè)備16-17
• 2.1.3 網(wǎng)絡(luò)資源及軟件17-18
• 2.1.4 主要試劑及耗材18-19
• 2.1.5 主要試劑的配制19-21
• 2.2 試驗方法21-38
• 2.2.1 ECE1基因的cDNA全長擴增21-25
• 2.2.2 cDNA全長的測序25-28
• 2.2.3 生物信息學(xué)分析28-30
• 2.2.4 三個豬種間的序列差異分析30-31
• 2.2.5 熒光定量PCR的檢測分析31-33
• 2.2.6 Western Blot的檢測分析33-37
• 2.2.7 數(shù)據(jù)分析37-38
• 3 結(jié)果與分析38-55
• 3.1 藏豬ECE1基因的cDNA全長的克隆38-39
• 3.1.1 總RNA的提取與質(zhì)量檢測38
• 3.1.2 5′RACE、3′RACE和中間片段的PCR擴增38-39
• 3.1.3 菌液PCR陽性鑒定結(jié)果39
• 3.2 測序結(jié)果分析39-41
• 3.3 生物信息學(xué)分析41-48
• 3.3.1 ORF區(qū)的預(yù)測41-42
• 3.3.2 蛋白質(zhì)氨基酸組成、分子量和等電點分析42
• 3.3.3 蛋白質(zhì)疏水性與二級結(jié)構(gòu)42-43
• 3.3.4 跨膜區(qū)和亞細胞定位的預(yù)測43-44
• 3.3.5 信號肽和二硫鍵預(yù)測44-45
• 3.3.6 糖基化和磷酸化位點預(yù)測45
• 3.3.7 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測45-46
• 3.3.8 序列間的多重比對和蛋白質(zhì)氨基酸分子進化樹46-48
• 3.4 三個豬種間的序列差異分析48-50
• 3.5 藏豬ECE1基因的表達檢測分析50-55
• 3.5.1 內(nèi)參基因的篩選50-51
• 3.5.2 qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線的制備51
• 3.5.3 藏豬ECE1基因的組織表達譜分析51-52
• 3.5.4 藏豬、萊蕪豬和大白豬不同組織中ECE1基因的表達差異分析52-55
• 4 討論55-59
• 4.1 ECE1的生物信息學(xué)分析55-56
• 4.2 三個豬種間的序列差異分析56-57
• 4.3 ECE1基因mRNA與蛋白質(zhì)的組織和品種差異表達57-59
• 5 結(jié)論59-60
• 參考文獻60-70
• 致謝70-71
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況71

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 ;藏豬[J];中國農(nóng)業(yè)信息;2005年09期

2 余先瓊;張擑予;帥素容;尹公鵬;楊顯彬;劉明剛;;亞丁藏豬生長發(fā)育研究初報[J];四川畜牧獸醫(yī);2007年08期

3 李洪濤;張新風(fēng);吳清洪;劉運忠;任麗華;顧為望;;高原藏豬在亞熱帶環(huán)境生長發(fā)育和繁殖特性的比較研究[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2008年01期

4 段誠中;;探秘天堂里的豬寶——藏豬[J];豬業(yè)科學(xué);2008年02期

5 強巴央宗;張浩;紀(jì)素玲;凌遙;王強;占堆;;藏豬屠宰性能和肉質(zhì)測定與分析[J];中國畜牧雜志;2008年21期

6 龔建軍;呂學(xué)斌;陳曉暉;曾凱;楊雪梅;梁艷;;藏豬生長發(fā)育性能研究[J];西南農(nóng)業(yè)學(xué)報;2009年02期

7 占堆;土登達杰;;藏豬本品種選育研究[J];西藏科技;2009年06期

8 張浩;強巴央宗;彭俊飛;楊濤;達娃卓瑪;吳常信;;藏豬肥胖基因多態(tài)性研究[J];中國畜牧獸醫(yī);2009年08期

9 呂學(xué)斌;鄒方東;趙森林;王高超;張宇;應(yīng)三成;曾凱;龔建軍;;藏豬種質(zhì)資源細胞遺傳學(xué)研究[J];四川動物;2009年06期

10 李云南;;鄉(xiāng)城縣藏豬資源的保護及建議[J];四川畜牧獸醫(yī);2009年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 段誠中;;探秘天堂里的豬寶——藏豬[A];養(yǎng)豬三十年記——紀(jì)念中國改革開放養(yǎng)豬30年文集（1978-2007）[C];2010年

2 呂學(xué)斌;劉銳;龔建軍;何志平;陳曉暉;曾凱;梁艷;;藏豬種質(zhì)特性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會養(yǎng)豬學(xué)分會第五次全國會員代表大會暨養(yǎng)豬業(yè)創(chuàng)新發(fā)展論壇論文集[C];2010年

3 李志娟;王麗娜;李治中;束剛;王松波;朱曉彤;高萍;江青艷;;放牧條件下不同生長階段藏豬的習(xí)性研究[A];全國動物生理生化第十二次學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2012年

4 強巴央宗;辜雪冬;劉志成;楊濤;張浩;;藏豬激素敏感脂肪酶基因遺傳多樣性分析[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

5 趙中權(quán);帥素容;李輝;劉海峰;蔣忠榮;;藏豬RYR1基因序列多態(tài)性分析[A];全國首屆動物生物技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2004年

6 劉銳;呂學(xué)斌;;藏豬CAST基因SNP與肌纖維性狀的關(guān)聯(lián)性分析[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

7 齊莎日娜;陳金永;郭榮富;余冰;陳代文;;藏豬與三元雜交豬β-defensin基因表達的差異[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物營養(yǎng)學(xué)分會第十次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

8 趙中權(quán);帥素容;李平;甘萬華;高鵬;;藏豬雌激素受體(ESR)基因PvuⅡ多態(tài)性分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2004學(xué)術(shù)年會暨第五屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2004年

9 李寶玉;強巴央宗;吳克亮;辜雪冬;張浩;;藏豬肝X受體(LXRs)基因多樣性研究[A];中國動物遺傳育種研究進展——第十五次全國動物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2009年

10 趙倩君;姚娜;關(guān)偉軍;馬月輝;;OE-PCR合成藏豬obese基因編碼序列及Leptin的原核表達[A];第十二次全國畜禽遺傳標(biāo)記研討會論文集[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 記者 張兵 陳建兵 益西貢布;我州藏豬基因研究全國領(lǐng)先[N];甘孜日報(漢文);2006年

2 本報記者　楊曉　記者　黃先明;從高原到市場 珍稀藏豬往哪兒走[N];四川日報;2006年

3 ;特養(yǎng)品種藏豬[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

4 記者 劉全洲;藏豬地方標(biāo)準(zhǔn)在我區(qū)正式實施[N];拉薩晚報;2011年

5 記者 盛利;我科學(xué)家揭示藏豬與家豬“基因密碼”[N];科技日報;2013年

6 徐家志;米林培訓(xùn)農(nóng)牧民種養(yǎng)殖技術(shù)[N];西藏日報;2006年

7 記者 江蕓涵;四川為何有大熊貓？藏豬基因研究有意外收獲[N];四川日報;2013年

8 尕瑪多吉;西藏林芝大養(yǎng)藏豬藏雞[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

9 記者 周華;我州加快發(fā)展藏豬藏雞產(chǎn)業(yè)[N];甘孜日報(漢文);2010年

10 陸仲t樠芯吭，

本文編號：306118