維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）作為一種人、獸及水生生物共患病原菌,在醫(yī)學(xué)界和科學(xué)界得到了較為廣泛的關(guān)注,通過(guò)對(duì)近年來(lái)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)A.veronii的毒力及其對(duì)藥物的耐受能力方面呈逐年增強(qiáng)的趨勢(shì),這也使得越來(lái)越多的國(guó)家意識(shí)到該病原菌的危害,并將其列為水體質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。目前針對(duì)A.veronii的研究大多集中在分離鑒定及藥敏試驗(yàn)上,而對(duì)其毒力因子及致病機(jī)制方面的研究相對(duì)較少,這也在一定程度上限制了對(duì)該病原菌的研究進(jìn)展,同時(shí)也使得越來(lái)越多的科研人員認(rèn)識(shí)到毒力因子方面研究的重要性。本試驗(yàn)基于課題組前期的研究結(jié)果上,篩選獲得了A.veronii強(qiáng)毒株TH0426中可能與其毒力相關(guān)的高表達(dá)蛋白--尸胺逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CadB,在對(duì)該蛋白的編碼基因進(jìn)行比對(duì)分析時(shí),又發(fā)現(xiàn)在該菌株中存在的賴氨酸脫羧酶與該蛋白相關(guān)性較高;進(jìn)而我們利用高效自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組法對(duì)A.veronii TH0426中這兩個(gè)蛋白的編碼基因cadA和cadB進(jìn)行了缺失,從而構(gòu)建了A.veronii TH0426的cadA和cadB基因缺失突變株,通過(guò)對(duì)缺失株、互補(bǔ)株及野生株相關(guān)生物學(xué)特性... 

【文章來(lái)源】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉林省

【文章頁(yè)數(shù)】：77 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

cadA基因上、下游基因的擴(kuò)增、連接A:TH0426基因組提��；B:cadA上游基因（UcadA）；C:cadA下游基因（DcadA）；D:

利用限制性內(nèi)切酶 Xba I 和 Sac I 對(duì)構(gòu)建成功的克隆載體 pEASY-UD cadA 和自殺性載體 pRE112 分別進(jìn)行酶切（如圖 1.2A），而后對(duì)目的片段與載體進(jìn)行連接，從而構(gòu)建重組自殺性載體 pRE112-UD cadA（如圖 1.2 B）；以重組自殺性載體 pRE112-UD cadA 為模板，利用 P13-1/P13-2對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證并測(cè)序，獲得大小為2649bp 的基因片段（如圖 1.2 C）；且測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)與原序列相符，表明成功構(gòu)建了重組自殺性載體 pRE112-UD cadA。圖 1.1 cadA 基因上、下游基因的擴(kuò)增、連接A:TH0426 基因組提��；B: cadA 上游基因（U cadA）；C: cadA 下游基因（D cadA）； D:cadA 上下游基因連接（UD cadA）；E: 鑒定 pEASY-UD cadA 質(zhì)粒Fig. 1.1 Amplification and connection of cadA upstream and downstream genesA:Gene of TH0426;B: cadA upstream gene（U cadA）;C: cadA downstream gene（D cadA）;D: cadA upstream and downstream genes（UD cadA）; E: PCR for pEASY-UD cadA

基因缺失突變片段整合至目標(biāo)菌株的基因組中，該過(guò)程代表了第一同源重組的發(fā)生；在對(duì)菌株進(jìn)行篩選時(shí)，我們發(fā)現(xiàn) PCR 結(jié)果中存在兩個(gè)目的片段，其中大小為 2244bp 的基因片段來(lái)源于重組自殺性載體所攜帶的 cadA 基因缺失突變片段另一個(gè)大小為 4377bp 的基因片段則來(lái)自細(xì)菌自身的基因組，該片段中包含了 UcadA 和 cadA ORF 基因片段，結(jié)果與預(yù)期相符（如圖 1.3 A）。但二次同源重組的發(fā)生，并不意味著所有菌株均會(huì)缺失目的基因，變?yōu)槿笔蛔冎辏粚?shí)則發(fā)生真正突變的菌株極少；大部分的菌株在二次同源重組發(fā)生后，均未缺失目的基因，只是隨著重組自殺性載體的崩解，恢復(fù)為野生株；而通過(guò)負(fù)向選擇獲得的疑似菌株對(duì)其提取基因組后（如圖 1.3 B），利用 P3-1/P3-2引物對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，缺失突變株只能擴(kuò)增出大小為 2307bp 的基因片段，而野生株則擴(kuò)增出大小為 4440bp 的基因片段，結(jié)果與預(yù)期相符（如圖 1.3 C）；隨后又利用 P4-1/P4-2引物對(duì)其再次進(jìn)行驗(yàn)證，缺失株未擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段，而野生株擴(kuò)增出大小為 815bp 的基因片段結(jié)果與預(yù)期相符（如圖 1.3 D）；結(jié)果表明已成功構(gòu)建 cadA 基因的缺失突變株△cadA。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]甲魚(yú)源致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及抑菌試驗(yàn)（英文）[J]. 朱芝秀,蔣新華,鄧舜洲,王倍,李輝鴻,徐添悅.  Agricultural Science & Technology. 2016(04)
[2]諾卡式菌和維氏氣單胞菌并發(fā)引起太陽(yáng)魚(yú)死亡一例[J]. 雷燕.  當(dāng)代水產(chǎn). 2016(03)
[3]加州鱸源維氏氣單胞菌的分離、鑒定及致病性[J]. 龍波,王均,賀揚(yáng),趙敏,王二龍,崔靜雯,鄧綠洲,劉韜,曾宇鯤,汪開(kāi)毓,陳德芳.  中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2016(01)
[4]團(tuán)頭魴致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 藺凌云,潘曉藝,袁雪梅,姚嘉赟,徐洋,尹文林,許婷,郝貴杰,沈錦玉.  水產(chǎn)養(yǎng)殖. 2015(07)
[5]細(xì)菌生物膜檢測(cè)方法改進(jìn)與應(yīng)用[J]. 尤理想,趙青,周敏,汪意濤,吳淑燕,李嫄淵,黃瑞.  實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理. 2015(03)
[6]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因組編輯的研究進(jìn)展[J]. 劉志國(guó).  畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2014(10)
[7]腹瀉患者糞便來(lái)源的氣單胞菌分布及耐藥性[J]. 葛檣檣,白永鳳,陳曉,余斐,鄭書(shū)發(fā),陳瑜.  中國(guó)老年學(xué)雜志. 2013(21)
[8]多胺與細(xì)菌病原的致病性[J]. 張艷霏,馬翠萍,譚訓(xùn)剛,鄒玉霞.  微生物學(xué)通報(bào). 2013(02)
[9]維氏氣單胞菌研究進(jìn)展[J]. 吳同壘,單曉楓,孟慶峰,郭偉生,王偉利,錢(qián)愛(ài)東.  中國(guó)獸藥雜志. 2011(07)
[10]框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J]. 龔倩,高淑琴,單曉楓,郭偉生,孟慶峰,王偉利,錢(qián)愛(ài)東.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2010(12)

碩士論文
[1]胸膜肺炎放線桿菌potD2基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性研究[D]. 趙雨.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[2]犬布魯氏菌菌殼疫苗株的構(gòu)建及實(shí)驗(yàn)免疫研究[D]. 錢(qián)晶.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[3]健康烏鱧體內(nèi)兩種氣單胞菌的分離、鑒定及其毒力基因檢測(cè)[D]. 胡天野.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013
[4]團(tuán)頭魴池塘維氏氣單胞菌的致病性、耐藥性、基因分型及其分布研究[D]. 周光.上海海洋大學(xué) 2012
[5]嗜水氣單胞菌J-1株ahyI基因缺失株的構(gòu)建及特性分析[D]. 薛玉玲.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012
[6]嗜水氣單胞菌J-1株β溶血素基因缺失株的構(gòu)建及特性分析[D]. 熊華萱.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3058737