玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN）是鐮刀菌產(chǎn)生的類(lèi)雌激素樣真菌毒素,不僅損傷動(dòng)物的肝腎,降低免疫機(jī)能,而且影響動(dòng)物的生殖性能,給牲畜養(yǎng)殖業(yè)及食品安全帶來(lái)了嚴(yán)重的危害。內(nèi)酯水解酶可以高效、環(huán)保的方式去除飼料中的霉菌毒素ZEN,有效助力畜牧行業(yè)綠色健康養(yǎng)殖。本研究旨在獲得可高效水解ZEN的酶,研究其生化特性以及催化機(jī)理,探索高效表達(dá)方案,推進(jìn)其在畜牧養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用。為了進(jìn)一步挖掘可高效水解ZEN的酶基因資源,以具有ZEN水解活性的內(nèi)酯水解酶ZHD101的氨基酸序列出發(fā),在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索分析,獲得了18個(gè)一致性較低的潛在ZEN水解酶基因序列,并通過(guò)在畢赤酵母中異源表達(dá)進(jìn)行活性篩選。結(jié)果表明:所有基因均實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá),5個(gè)檢測(cè)到明顯活性。其中,來(lái)源于Phialophora americana的假想蛋白ZHD607對(duì)ZEN的降解效率高達(dá)100%,比活達(dá)到4940 U/mg。為了進(jìn)一步研究其催化機(jī)理,本研究選取了與ZHD607一致性較高（74%）的內(nèi)酯水解酶RmZHD為對(duì)比材料。RmZHD具有更高的比活性（12,288 U/mg）,是ZHD607的2.5倍。通過(guò)對(duì)ZHD607進(jìn)行... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

玉米赤霉烯酮及雌激素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1-1Chemicalstructuralformulaofzearalenoneandestrogen

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論6圖1-2ZEN的水解過(guò)程Fig.1-2HydrolysisofZEN1.3.2ZEN降解酶研究進(jìn)展目前為止，已被成功分離并進(jìn)行異源表達(dá)的ZEN降解酶基因不多，其中zhd101是被研究最多的一個(gè)降解酶基因，已成功在大腸桿菌（Escherichiacoli），畢赤酵母（PichiaPastoris），乳桿菌（Lactobacillusreuteri），水稻（Rice）等宿主中表達(dá)（WANGetal.,2018;YANGetal.,2017;HIGA-NISHIYAMAetal.,2005）6。ZHD101為內(nèi)酯水解酶，內(nèi)酯酶因?yàn)闀?huì)干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)微生物生長(zhǎng)和發(fā)病機(jī)制而受到廣泛關(guān)注。“猝滅”群體信號(hào)的一個(gè)主要機(jī)制是通過(guò)內(nèi)酯酶和�；饷噶呀夂蜏缁罴�(xì)菌N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（AHL）。ZEN和AHL的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常不同，相應(yīng)的開(kāi)環(huán)反應(yīng)和催化酶也是如此。AHL內(nèi)酯酶包括metallo-β-內(nèi)酰胺酶折疊酶、(β/α)8-氨基水解酶折疊酶和α/β-水解酶折疊酶。ZHD101屬于后者（PENGetal.,2014）6。與其他一些AHL內(nèi)酯酶（如AiiA）不同，ZHD101不需要金屬離子輔助發(fā)揮活性。除了具有包含Ser/Cys-His-Asp/Glu催化三聯(lián)體的催化核心結(jié)構(gòu)域外，α/β-水解折疊內(nèi)酯酶（如烯醇內(nèi)酯水解酶PcaD）還包含α-螺旋帽子結(jié)構(gòu)域，覆蓋活性部位并確定底物特異性。在核心結(jié)構(gòu)域和帽子結(jié)構(gòu)域之間有一個(gè)深的隧道狀空腔來(lái)容納底物。ZHD101被發(fā)現(xiàn)后，其他酶也相繼被發(fā)現(xiàn)具有明顯的ZEN降解效果。例如，從Rhinocladiellamackenziei分離得到的ZHD518對(duì)ZEN、α-zearalenol、β-zearalenol、α-zearalanol和β-zearalanol具有顯著的內(nèi)酯水解酶活性，其活性分別為12,420、1,380、3,882、7,188和3,990U/mg（WANGetal.,2018）6。CbZHD來(lái)源于Cladophialophorabantiana，對(duì)ZEN和α-zearalenol具有內(nèi)酯水解酶活性（分別為12,301和2,163U/mg），但這些內(nèi)酯水解酶的水解效率較?

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文第一章緒論7Ser102-His242-Glu126，進(jìn)一步確認(rèn)了催化三聯(lián)體的酸性殘基是Glu126，而不是先前提出的Asp223。在催化三聯(lián)體的作用下，ZEN的內(nèi)酯環(huán)可被裂解并伴隨著二氧化碳釋放，生成二羥基苯甲基衍生物，然后從活性部位移出。Glu126位于β6折疊片的C末端，距離與位于β5的Ser102很近。His242位于靠近β8-β11的loop上，在S102A/ZEN復(fù)合物中，His242的NE2原子與ZEN的酯氧（O10’）的距離為3.4，為質(zhì)子轉(zhuǎn)移到底物提供了便利。當(dāng)突變體與野生型結(jié)構(gòu)疊加時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ser102的OG原子與ZEN的羰基碳（C12）相距2.2，具有很高的親核攻擊潛力。羰基氧（O12）與Gly32的NH形成氫鍵，可能對(duì)穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)中的負(fù)電荷有積極作用。圖1-3ZHD101單體結(jié)構(gòu)（PDBID:3WZM）Fig.1-3StructureofZHD101monomer（PDBID:3WZM）在催化口袋的另一側(cè)，Trp183垂直于ZEN的二羥基苯甲酸環(huán)，在兩個(gè)芳香族基團(tuán)之間形成T-堆疊相互作用，并且Trp183的NE1與底物的O2形成氫鍵，與Ser103的側(cè)鏈（OG）也形成氫鍵。郭瑞庭等人研究發(fā)現(xiàn)突變體W183F、W183H和W183A均為ZEN降解活性，表明了Trp183對(duì)于催化活性的重要作用。除Trp183的吲哚基外，Leu33、Val153、Met154、Val158、Leu135、Phe221、Pro128、Ile191和Pro192的脂肪族側(cè)鏈與底物直接接觸。對(duì)于Trp183，QI等（2017）人還發(fā)現(xiàn)對(duì)于ZHD-ZEN和ZHD-ZGR（產(chǎn)物）復(fù)合物結(jié)構(gòu)的比較表明，親水性相互作用發(fā)生了變化，特別是Trp183N1從與O2相互作用轉(zhuǎn)變?yōu)榕cO12’相互作用，表明Trp183是催化過(guò)程中ZEN苯酚環(huán)單向平移運(yùn)動(dòng)的原因。這種結(jié)構(gòu)提供了玉米赤霉烯酮內(nèi)酯水解酶催化機(jī)理的最后階段的構(gòu)象變化信息（圖1-4）。

【參考文獻(xiàn)】：
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