作為皰疹病毒目（Herpesvirales）皰疹病毒科（Herpesvirales）α-皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）馬立克病毒屬（Mardivirus）的一員,鴨瘟病毒（Duck plague virus, DPV）是一種泛嗜性全身性感染病毒,主要引起鴨、鵝、天鵝等雁形目水禽的急性接觸性傳染病——鴨瘟。該病以血管損傷、組織出血、消化道黏膜糜爛、淋巴器官出現(xiàn)病變及實質(zhì)器官的退行性變化為特征,是影響水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病。目前,主要依靠接種滅活疫苗和雞胚化弱毒苗來預防鴨瘟的發(fā)生。滅活疫苗安全性好,但免疫維持期短、劑量較大、成本較高；雞胚化弱毒苗雖然免疫效果較好,但是存在毒力返強和隱性帶毒等安全隱患,而且現(xiàn)有的診斷方法無法區(qū)別自然感染野毒和弱毒疫苗免疫的動物。因此,研制更為安全有效的新型基因工程疫苗具有重要的理論和應用價值。生物信息學分析表明鴨瘟病毒糖蛋白C （glycoprotein C, gC）在不同毒株間高度保守,原核表達結(jié)果顯示gC具有良好的免疫原性。因此,本研究選擇gC基因作為保護性抗原基因,將其克隆至真核表達載體pcDNA3.1（+）以構(gòu)建鴨瘟病毒gC基因疫... 

【文章來源】：四川農(nóng)業(yè)大學四川省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：124 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
常用英文縮寫詞匯
目錄
第一部分 引言
    1. 鴨瘟病毒研究概況
        1.1. 鴨瘟病毒發(fā)現(xiàn)歷史及名稱
        1.2. 鴨瘟病毒的分類地位
        1.3. 鴨瘟病毒生物學特性
        1.4. 鴨瘟病毒分子生物學研究現(xiàn)狀
        1.5. 鴨瘟病毒gC、gE基因研究現(xiàn)狀
    2. 鴨瘟病毒gC基因在基因疫苗研究中的應用
    3. 定量PCR在檢測基因疫苗體內(nèi)分布規(guī)律研究中的優(yōu)越性
    4. gC、gE基因缺失株在鴨瘟病毒研究中的意義
第二部分 實驗研究
    1. 實驗目的和意義
    2. 實驗材料
        2.1. 病毒毒株、細菌菌株
        2.2. 實驗動物
        2.3. 質(zhì)粒和載體
        2.4. 分子生物學試劑和耗材
        2.5. 常用實驗試劑及配制
        2.6. 常用實驗設備
    3. 實驗方法
        3.1. 鴨瘟病毒gC基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
            3.1.1. 鴨瘟病毒gC基因片段的獲取
            3.1.2. 真核表達載體pcDNA3.1（+）的線性化
            3.1.3. 感受態(tài)細胞的制備
            3.1.4. 線性化pcDNA3.1（+）和DPV gC基因片段的連接
            3.1.5. 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.1.6. 重組質(zhì)粒的抽提、酶切鑒定與保存
            3.1.7. 間接免疫熒光法檢測pcDNA-DPV-gC在真核細胞中的表達
        3.2. 定量PCR檢測鴨瘟病毒gC基因疫苗在鴨體內(nèi)分布規(guī)律
            3.2.1. 真核表達質(zhì)粒pcDNA-DPV-gC的制備
            3.2.2. 基因槍“子彈”的制備及初步使用
            3.2.3. 殼聚糖/pcDNA-DPV-gC復合物的制備
            3.2.4. 脂質(zhì)體/pcDNA-DPV-gC復合物制備
            3.2.5. 試驗分組與免疫
            3.2.6. 樣品采集
            3.2.7. 模板DNA的提取
            3.2.8. 定量PCR檢測鴨瘟病毒gC基因疫苗在鴨體內(nèi)的動態(tài)分布規(guī)律
        3.3. 鴨瘟病毒gC基因缺失株的構(gòu)建與鑒定
            3.3.1. 鴨瘟病毒基因組核酸的制備
            3.3.2. 轉(zhuǎn)移載體左右臂的構(gòu)建和鑒定
            3.3.3. 重組質(zhì)粒pUC-△gC的構(gòu)建
            3.3.4. EGFP表達盒的獲取
            3.3.5. 含EGFP基因表達盒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體的構(gòu)建
            3.3.6. 重組鴨瘟病毒DPV-△gC-EGFP的構(gòu)建
            3.3.7. 重組鴨瘟病毒DPV-△gC-EGFP的鑒定
        3.4. 重組鴨瘟病毒DPV-△gC-EGFP的生物學特性研究
            3.4.1. 空斑試驗
            3.4.2. 一步生長曲線
            3.4.3. 形態(tài)學觀察
            3.4.4. 動物實驗
        3.5. 鴨瘟病毒gE基因缺失株的構(gòu)建與鑒定
            3.5.1. 轉(zhuǎn)移載體左右臂的構(gòu)建和鑒定
            3.5.2. 重組質(zhì)粒pUC-△gE-EGFP的構(gòu)建
            3.5.3. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的構(gòu)建與鑒定
        3.6. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的生物學特性研究
            3.6.1. 空斑試驗
            3.6.2. 一步生長曲線
            3.6.3. 形態(tài)學觀察
            3.6.4. 動物實驗
    4. 實驗結(jié)果
        4.1. 真核表達質(zhì)粒pcDNA-DPV-gC的構(gòu)建與鑒定
            4.1.1. 真核表達質(zhì)粒pcDNA-DPV-gC的構(gòu)建結(jié)果
            4.1.2. 間接免疫熒光鑒定pcDNA-DPV-gC在COS-7細胞中的表達
        4.2. 鴨瘟病毒gC基因疫苗在鴨體內(nèi)分布規(guī)律
            4.2.1. 高密度發(fā)酵影響因素
            4.2.2. 鴨瘟病毒gC基因疫苗的鑒定
            4.2.3. 免疫接種鴨臨床表現(xiàn)及組織DNA抽提情況
            4.2.4. 定量PCR檢測鴨瘟病毒gC基因疫苗在接種鴨體內(nèi)分布情況
        4.3. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的構(gòu)建與鑒定
            4.3.1. 轉(zhuǎn)移載體pUC-△gC-EGFP的構(gòu)建
            4.3.2. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的構(gòu)建與生長特性初步觀察
            4.3.3. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的鑒定
        4.4. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的生物學特性初步觀察
            4.4.1. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的空斑試驗結(jié)果
            4.4.2. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的一步生長曲線
            4.4.3. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP的形態(tài)觀察
            4.4.4. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP對鴨的致病性
            4.4.5. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP引起鴨中和抗體的變化
            4.4.6. 鴨瘟重組病毒DPV-△gC-EGFP對鴨的保護作用
        4.5. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的構(gòu)建與鑒定
            4.5.1. 轉(zhuǎn)移載體pUC-△gE-EGFP的構(gòu)建
            4.5.2. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的構(gòu)建與生長特性初步觀察
            4.5.3. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的鑒定結(jié)果
        4.6. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的生物學特性初步觀察
            4.6.1. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的空斑試驗結(jié)果
            4.6.2. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的一步生長曲線
            4.6.3. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP的形態(tài)觀察
            4.6.4. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP對鴨的致病性
            4.6.5. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP引起鴨的中和抗體變化
            4.6.6. 重組鴨瘟病毒DPV-△gE-EGFP對鴨的保護作用
    5. 討論
        5.1. 真核表達質(zhì)粒pcDNA-DPV-gC的構(gòu)建與鑒定
            5.1.1. 真核表達質(zhì)粒pcDNA-DPV-gC的構(gòu)建
            5.1.2. 真核表達質(zhì)粒的鑒定
        5.2. 鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)分布規(guī)律
            5.2.1. 基因組核酸樣品中影響定量PCR反應的因素
            5.2.2 .免疫佐劑對鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)分布的影響
            5.2.3. 免疫途徑對鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)分布的影響
            5.2.4. 免疫劑量對鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)分布的影響
        5.3. 鴨瘟病毒基因缺失株構(gòu)建方法的選擇
        5.4. 不同空斑檢測方法在鴨瘟病毒研究方面的應用
        5.5. 鴨瘟病毒gC缺失重組株生物學特性初步研究結(jié)果
        5.6. 鴨瘟病毒gE缺失重組株生物學特性初步研究結(jié)果
第三部分 總結(jié)
參考文獻
附錄
致謝
攻讀學位期間發(fā)表學術論文情況


【參考文獻】：
期刊論文
[1]鴨瘟病毒gD基因胞外區(qū)的原核表達及ELISA檢測方法的建立與應用[J]. 范薇,程安春,汪銘書,隋麗華,孫巖松.  中國獸醫(yī)科學. 2012(05)
[2]鴨腸炎病毒核衣殼蛋白受體的篩選與鑒定[J]. 張荷,毛君婷,楊穎,王開功,周碧君,文明.  病毒學報. 2012(01)
[3]鴨腸炎病毒gC糖蛋白胞外區(qū)優(yōu)勢抗原表位的篩選與鑒定[J]. 崔立虹,宋鴿,王曉東,劉曉玫,高明春,張文龍,馬波,王君偉.  畜牧獸醫(yī)學報. 2011(08)
[4]鴨瘟病毒UL47基因克隆及其分子特性分析[J]. 羅丹丹,程安春,汪銘書,沈愛梅,朱德康,賈仁勇,羅啟慧,崔恒敏,王印,徐志文.  中國獸醫(yī)學報. 2011(01)
[5]鴨瘟病毒UL35基因克隆、原核表達及在病毒感染宿主中的亞細胞定位[J]. 蔡銘升,程安春,汪銘書,朱德康,羅啟慧,招麗嬋,賈仁勇,劉菲,陳孝躍.  病毒學報. 2010(02)
[6]鴨腸炎病毒UL41、UL42基因的克隆與分析[J]. 陳普成,柳金雄,曾青華,姜永萍,田國彬,陳化蘭.  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(12)
[7]鴨瘟病毒UL26.5基因的克隆和編碼蛋白的亞細胞定位[J]. 張瑤,程安春,汪銘書,賈仁勇,朱德康,劉菲,羅啟慧,陳孝躍.  中國獸醫(yī)科學. 2009(11)
[8]鴨瘟病毒UL51基因在COS-7細胞中的瞬時表達[J]. 沈嬋娟,程安春,汪銘書,郭宇飛,信洪一,徐超,賈仁勇,韓新峰.  中國獸醫(yī)科學. 2009(10)
[9]鴨腸炎病毒VP22蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J]. 王克雄,李慧昕,李陽,邵昱昊,韓宗璽,馬小軍,劉勝旺,孔憲剛.  中國預防獸醫(yī)學報. 2009(09)
[10]SARS-CoV細胞空斑試驗[J]. 蔣虹,喬紅偉,叢喆,佟巍,魏強.  中國比較醫(yī)學雜志. 2009(08)

博士論文
[1]鴨瘟病毒gC基因的發(fā)現(xiàn)、原核表達和應用研究[D]. 徐超.四川農(nóng)業(yè)大學 2008

碩士論文
[1]鴨瘟病毒gC基因部分特征分析及gC基因疫苗誘導鴨免疫發(fā)生的研究[D]. 練蓓.四川農(nóng)業(yè)大學 2011
[2]鴨腸炎病毒gC基因疫苗誘導BALB/c小鼠免疫發(fā)生的研究[D]. 蔣金鳳.四川農(nóng)業(yè)大學 2010
[3]鴨瘟病毒gC基因疫苗在雛鴨體內(nèi)的抗原表達時相和分布規(guī)律[D]. 沈福曉.四川農(nóng)業(yè)大學 2010
[4]基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠體內(nèi)分布規(guī)律的研究[D]. 鄒慶.四川農(nóng)業(yè)大學 2010
[5]鴨α-干擾素基因疫苗高密度發(fā)酵及免疫鴨抗鴨瘟強毒人工感染的研究[D]. 周雪.四川農(nóng)業(yè)大學 2007
[6]小鵝瘟病毒VP3基因疫苗在免疫雛鵝體內(nèi)動態(tài)分布及表達規(guī)律的研究[D]. 黎敏.四川農(nóng)業(yè)大學 2007
[7]鴨α-干擾素核酸疫苗在鴨體內(nèi)的動態(tài)分布及表達產(chǎn)物抗鴨瘟強毒效果初探[D]. 段坤.四川農(nóng)業(yè)大學 2007



本文編號：3057947