本文關(guān)鍵詞：犏牛雄性不育相關(guān)蛋白篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：犏牛的雄性不育是由于精子發(fā)生阻滯造成的,由此導致牦牛育種中無法對犏牛雜合優(yōu)秀基因的有效利用,在研究犏牛精子發(fā)生阻滯機制機理方面,雖然前人已經(jīng)做了一些工作,但是犏牛和牦牛之間睪丸蛋白質(zhì)比較組學的研究尚未報道,因此在睪丸蛋白組學水平篩選可能導致犏牛精子發(fā)生阻滯的重要蛋白并深入研究其功能具有重要的生殖生物學基礎(chǔ)理論意義。本研究應(yīng)用iTRAQ方法對牦牛和犏牛睪丸蛋白組進行比較研究,鑒定出了256個顯著差異表達蛋白,其中大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)激反應(yīng)(特別是炎癥性應(yīng)激)、增強生精細胞間黏附性或抑制生精細胞向曲細精管官腔的遷移,而許多下調(diào)蛋白主要與精子發(fā)生中多種細胞代謝缺陷和細胞分化過程有關(guān),這項研究發(fā)現(xiàn)的很多重要蛋白可能與犏牛精子發(fā)生阻滯相關(guān),這些蛋白將對犏牛精子發(fā)生阻滯分子機制的深入研究提供重要信息和切入點。主要研究結(jié)果如下:1.從犏牛和牦牛睪丸組織切片可以看出,犏牛睪丸曲細精管外膜萎縮且不規(guī)整,可能是由細胞凋亡引起的。在牦牛曲細精管中,從基底膜到管腔分布有各級生精細胞,包括精原細胞、精母細胞、圓形或長形精子細胞。然而,在犏牛曲細精管中,基底膜只分布有單層的精原細胞,精母細胞數(shù)量較少,幾乎沒有圓形或長形精子細胞。2.在犏牛和牦牛睪丸表達差異蛋白中,排在前四位的上調(diào)蛋白是PTX3,S-100,H1.0和Osteoglycin,其差異倍數(shù)分別為3.8,3.5,3.1和2.9,相比之下,排在前四位下調(diào)蛋白是MHC class II,Ropporin-1,SNRPF protein和Protamine 2,差異倍數(shù)分別為-6.9,-4.7,-4.5和-4.2。3.大量上調(diào)蛋白可能參與多種應(yīng)激反應(yīng)(特別是炎癥性應(yīng)激)、增強生精細胞間黏附性或抑制生精細胞向曲細精管管腔的遷移。一些高表達蛋白(ICAM1,微纖絲相關(guān)糖蛋白4(MFAP4),胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白前體7(IGFBP7),Dermatopontin(DPT),整合素α9(ITGA9),整合素β1(ITGB1)可以提高細胞的粘附力,阻礙生殖細胞從基底膜脫離向生精小管管腔內(nèi)遷移。4.許多下調(diào)蛋白與精子發(fā)生過程中各種代謝過程和細胞過程的缺陷有關(guān)。PIWIL1和TDRD1表達下降可能影響PIWI或piRNA在保護生殖細胞基因組的完整性的功能;Gpx4在精母細胞中耗竭,引起精子嚴重異常,這可能也是雄性不育的原因;線粒體細胞色素BC1復合體亞基2、7和9的下調(diào),與阿爾茨海默病的途徑和氧化磷酸化有關(guān),這可能會導致線粒體功能障礙和犏牛睪丸生殖細胞凋亡;PSME4是一種大量表達的核蛋白,PSME4的缺失,導致雄性生育能力明顯下降,總之,參與各種代謝過程的蛋白表達下調(diào)可能導致精子發(fā)生阻滯。5.本研究通過對465個差異表達蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫通路富集,共獲得了15個顯著富集通路,其中排在前五的是細胞外基質(zhì)受體相互作用(P=0.0003843598),蛋白質(zhì)的消化和吸收(P=0.0007844198),阿爾茨海默氏病(P=0.002146642),核糖體(P=0.004046523)和磷酸戊糖通路(P=0.006084241)。在細胞外基質(zhì)受體相互作用通路中,整合素及其配體的過表達(細胞外基質(zhì))可能有助于生精細胞耐受拉力而不被牽離。通過對阿爾茨海默病和氧化磷酸化通路的綜合分析表明,諸如線粒體細胞色素BC1復合體亞基等蛋白的下調(diào)可能導致犏牛睪丸細胞線粒體功能障礙和細胞凋亡。6.本研究同樣采用iTRAQ方法研究不同發(fā)育階段的犏牛睪丸蛋白組的差異(P1-10月齡,P2-12月齡,P3-14月齡)。P2與P1階段相比,蛋白質(zhì)組分析鑒定出318個差異表達蛋白,P3與P1階段相比,共有327個差異表達蛋白。P2與P1,P3與P1相比,差異表達的蛋白GO注釋并沒有明顯的差異,這可以歸因于它們的早期發(fā)育過程中的犏牛睪丸生精就受到阻滯。另一方面,P2,P3與P1階段相比,有56共同差異表達的蛋白,大部分蛋白與催化、分子轉(zhuǎn)運、氧化還原酶和蛋白結(jié)合相關(guān)。進一步分析表明,差異表達的蛋白包括HBPs,Tudor domain containing 1,HSPA2,17_HSDXI,2,4-dienoyl-CoA reductase和Prx2可能與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生相關(guān),可作為候選蛋白在今后的研究中揭示犏牛雄性不育分子機制。
【關(guān)鍵詞】：犏牛 牦牛 睪丸 蛋白質(zhì)組 犏牛精子發(fā)生阻滯
【學位授予單位】：西南科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 1 緒論14-21
• 1.1 犏牛的基本概況及其研究現(xiàn)狀14-17
• 1.1.1 犏牛的基本概況14-15
• 1.1.2 犏牛雄性不育機制研究現(xiàn)狀15-17
• 1.2 蛋白質(zhì)組學研究概況17-20
• 1.2.1 蛋白質(zhì)組學概念及主要研究內(nèi)容17
• 1.2.2 蛋白質(zhì)組學主要技術(shù)17-18
• 1.2.3 蛋白質(zhì)組學研究的新技術(shù)18
• 1.2.4 iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學原理18-19
• 1.2.5 iTRAQ技術(shù)的優(yōu)勢19-20
• 1.3 犏牛雄性不育研究目的和意義20-21
• 2 犏牛和牦牛睪丸解剖組織結(jié)構(gòu)研究21-27
• 2.1 實驗材料21-22
• 2.1.1 動物樣品的采集21
• 2.1.2 主要儀器與設(shè)備21-22
• 2.1.3 主要試劑及配制22
• 2.2 方法22-23
• 2.3 結(jié)果與分析23-25
• 2.4 討論25-27
• 3 犏牛與牦牛睪丸蛋白組學比較分析27-65
• 3.1 實驗材料27-29
• 3.1.1 實驗動物睪丸組織的采集27
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備27-28
• 3.1.3 主要工具酶及試劑28-29
• 3.2. 方法29-36
• 3.2.1 睪丸組織蛋白提取29-30
• 3.2.2 蛋白質(zhì)濃度Bradford定量30
• 3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳30-31
• 3.2.4 蛋白質(zhì)酶解31
• 3.2.5 iTRAQ標記31-32
• 3.2.6 強陽離子交換色譜（Strong Cation Exchange chromatographic, SCX）分離32
• 3.2.7 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析32-33
• 3.2.8 標準生物信息分析流程33-34
• 3.2.9 犏牛雄性不育相關(guān)蛋白表達水平的ELISA分析方法34-36
• 3.2.10 ELISA實驗數(shù)據(jù)處理36
• 3.3 結(jié)果與分析36-61
• 3.3.1 蛋白定量結(jié)果36-38
• 3.3.2 顯著差異蛋白統(tǒng)計38
• 3.3.3 蛋質(zhì)豐度分布結(jié)果38-40
• 3.3.4 犏牛和牦牛睪丸組織中差異表達蛋白統(tǒng)計分析40-47
• 3.3.5 差異表達蛋白的功能分析47-49
• 3.3.6 差異表達蛋白GO分析49-56
• 3.3.7 差異表達蛋白的Pathway富集分析56-59
• 3.3.8 相關(guān)差異表達蛋白表達水平的ELISA分析59-61
• 3.4 討論61-65
• 3.4.1 在犏牛睪丸中上調(diào)的蛋白質(zhì)可能導致生精小管結(jié)構(gòu)異常61-62
• 3.4.2 直接參與精子生成過程的調(diào)節(jié)蛋白62-63
• 3.4.3 一些可能與多種應(yīng)激相關(guān)的差異蛋白63
• 3.4.4 在精子發(fā)生過程中，有可能與生精細胞代謝缺陷相關(guān)的蛋白63-64
• 3.4.5 相關(guān)差異表達蛋白的ELISA驗證64-65
• 4 犏牛不同發(fā)育階段（P1，，P2，P3）的差異表達蛋白比較分析65-78
• 4.1 實驗材料65
• 4.1.1 實驗動物睪丸組織的采集65
• 4.1.2 主要儀器與設(shè)備65
• 4.1.3 主要工具酶及試劑65
• 4.2 方法65-66
• 4.3 結(jié)果與分析66-75
• 4.3.1 不同發(fā)育階段的差異表達蛋白66-69
• 4.3.2 與P1相比，P2和P3階段共同差異表達蛋白69-72
• 4.3.3 與P1相比，在P2和P3階段共同差異表達蛋白的功能分析72-75
• 4.4 討論75-78
• 結(jié)論78-79
• 致謝79-80
• 參考文獻80-88
• 攻讀學位期間發(fā)表的與學位論文內(nèi)容相關(guān)的學術(shù)論文及研究成果88

  本文關(guān)鍵詞：犏牛雄性不育相關(guān)蛋白篩選研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：305063