本文關(guān)鍵詞：山東H9N2亞型禽流感病毒對(duì)α-2,6唾液酸受體親和性變化及血凝素蛋白糖基化對(duì)病毒致病性影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一種傳染性疾病,根據(jù)致病性的強(qiáng)弱可以分為高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8個(gè)片段組成,其中血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主細(xì)胞上的受體結(jié)合,HA蛋白主要結(jié)合兩種形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的類(lèi)型不同在一定程度上決定了流感病毒感染宿主的不同。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)H9N2亞型禽流感病毒不僅可以感染禽類(lèi),也可以可感染哺乳動(dòng)物包括小鼠、豚鼠、雪貂、靈長(zhǎng)類(lèi)。血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)養(yǎng)殖從業(yè)人員血清中H9N2流感病毒抗體的陽(yáng)性率達(dá)2.3%-13.7%,這表明H9N2亞型禽流感病毒已經(jīng)獲得跨越種間屏障感染哺乳動(dòng)物甚至是人的能力,因而具有引發(fā)新的流感大流行的潛在威脅。H9N2亞型AIV可以為新發(fā)流感病毒提供供體,如1997年香港流行的H5N1亞型流感病毒,其內(nèi)部基因可能來(lái)源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分離株。2013年流行的H7N9亞型AIV的內(nèi)部基因有6個(gè)來(lái)自H9N2亞型AIV。因此,加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型AIV對(duì)人源受體親和性變化的檢測(cè)以及病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病機(jī)制研究具有重要的公共衛(wèi)生意義。本研究對(duì)2001-2013間分離的12株H9N2亞型禽流感病毒的HA基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn):12株AIV盡管都屬于Y-280這一大分支,但是又可以分為4個(gè)小的分支,這表明H9N2亞型禽流感病毒也在發(fā)生變異,盡管變異速度沒(méi)有H5亞型禽流感那么快速。固相結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明:不同的分離年代H9N2亞型AIV對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和能力存在差異,總的趨勢(shì)是:隨著分離年代臨近,病毒對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和能力逐漸增強(qiáng),其中2013年分離株(A/Chicken/Shandong/903,簡(jiǎn)稱(chēng)CK/SD/903)對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和性最強(qiáng),2006年分離株(A/Chicken/Shandong/274,簡(jiǎn)稱(chēng)CK/SD/274)對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和性最弱。通過(guò)對(duì)CK/SD/903和CK/SD/274這兩個(gè)模型毒株的HA蛋白糖基化位點(diǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn):CK/SD/903的血凝素蛋白分別在200和295位比CK/SD/274多了兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn),為了驗(yàn)證這兩個(gè)位點(diǎn)糖基化是否影響病毒對(duì)α-2,6受體唾液酸受體親和性,我們構(gòu)建了CK/SD/903的8質(zhì)粒反向遺傳操作系統(tǒng),并且對(duì)CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸進(jìn)行突變,得到2個(gè)突變病毒。固相結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果表明HA N200Q(200位由N變?yōu)镼),而HA N295Q(295位由N變?yōu)镼)可以減弱病毒對(duì)α-2,6受體唾液酸受體親和性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩個(gè)位點(diǎn)的糖基化是否影響病毒對(duì)哺乳動(dòng)物致病性,分別用106EID50的野毒和突變病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周齡小白鼠。攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明:HAN200Q(200位由N變?yōu)镼)后,盡管突變病毒對(duì)小鼠的體重沒(méi)有明顯影響,但是可以提高病毒在小白鼠腎臟等器官?gòu)?fù)制能力(病毒基因相對(duì)表達(dá)量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N變?yōu)镼)突變后,可以提高病毒在小白鼠肝臟等器官的復(fù)制能力(病毒基因相對(duì)表達(dá)量是野毒的56倍)。本研究系統(tǒng)的研究了2001-2013年間的12株H9N2亞型禽流感病毒HA基因進(jìn)化和病毒對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和性,結(jié)果表明:H9N2亞型流感禽流感病毒存在一定程度變異,盡管不如H5亞型流感那么明顯;隨著分離年代臨近,病毒對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和性逐漸增強(qiáng)。利用反向遺傳操作技術(shù)驗(yàn)證了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影響病毒對(duì)α-2,6唾液酸受體的親和性變化,并且這兩個(gè)位點(diǎn)糖基化能夠影響病毒對(duì)小白鼠組織嗜性。這為闡明H9N2亞型流感病毒跨種間傳播的分子遺傳機(jī)制提供重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),并且能夠?yàn)镠9N2亞型流感病毒感染哺乳動(dòng)物或者人提供預(yù)警,因此本研究具有重要的獸醫(yī)指導(dǎo)意義和公共衛(wèi)生意義。
【關(guān)鍵詞】：禽流感 受體親和性 糖基化位點(diǎn) 致病性
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-25
• 1.1 流感病毒的流行史13-15
• 1.2 流感病毒結(jié)構(gòu)及感染宿主細(xì)胞的過(guò)程15-19
• 1.2.1 流感病毒的結(jié)構(gòu)15-17
• 1.2.2 病毒粒子與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合17-18
• 1.2.3 病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞18
• 1.2.4 病毒核糖核蛋白（vRNP）的入核18
• 1.2.5 病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制18-19
• 1.2.6 核糖核蛋白的出核19
• 1.2.7 病毒粒子的組裝和釋放19
• 1.3 流感病毒受體19-24
• 1.4 糖基化對(duì)病毒受體親和性和致病性的影響24
• 1.5 本研究的目的意義24-25
• 2 材料與方法25-39
• 2.1 試驗(yàn)材料25-26
• 2.1.1 試驗(yàn)毒株及載體25
• 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 試驗(yàn)儀器25-26
• 2.1.5 主要試劑的配置26
• 2.2 試驗(yàn)方法26-39
• 2.2.1 12株病毒HA基因的克隆測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析26-29
• 2.2.2 固相結(jié)合試驗(yàn)分析禽流感病毒受體親和性的變化趨勢(shì)29-30
• 2.2.3 CK/SD/903反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建30-34
• 2.2.4 點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建與點(diǎn)突變病毒的拯救34-36
• 2.2.5 CK/SD/903和突變病毒生物學(xué)特性分析36-39
• 3 結(jié)果39-48
• 3.1 H9N2亞型禽流感病毒氨基酸序列分析39
• 3.2 H9N2亞型禽流感病毒遺傳進(jìn)化分析39-41
• 3.3 固相結(jié)合試驗(yàn)分析受體親和性變化趨勢(shì)41-42
• 3.4 CK/SD/903病毒反向遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建42-44
• 3.5 點(diǎn)突變質(zhì)粒的構(gòu)建以及糖基化位點(diǎn)驗(yàn)證44-45
• 3.5.1 點(diǎn)突變質(zhì)粒構(gòu)建及突變病毒的拯救44
• 3.5.2 SDS-PAGE驗(yàn)證突變病毒和野毒糖基化位點(diǎn)44-45
• 3.6 突變病毒受體親和性變化及致病性試驗(yàn)45-48
• 3.6.1 突變病毒受體親和性變化45-46
• 3.6.2 突變病毒對(duì)SPF胚和小白鼠的致病性46-47
• 3.6.3 利用熒光定量分析病毒在小白鼠內(nèi)臟器官基因的相對(duì)表達(dá)量47-48
• 4 討論48-52
• 5 結(jié)論52-53
• 參考文獻(xiàn)53-60
• 致謝60-61
• 附錄61-62
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章62

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本文編號(hào)：304354