本文關鍵詞：表達空腸彎曲菌保護性抗原cfrA、cjaA基因的重組乳酸菌的構建及口服免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)是彎曲菌屬的一種微需氧革蘭氏陰性菌,可在宿主腸道中定殖和感染引起多種疾病,如感染人引起腸炎和腹瀉,是人最重要的食源性病原菌之一�？刂萍仪輳澢奈廴臼墙档腿烁腥驹摼钪苯佑行У氖侄�,本研究擬結(jié)合特異性與非特異性免疫,將空腸彎曲菌保護性抗原基因?qū)胧称芳壢樗峋磉_系統(tǒng),構建表達保護性抗原的重組乳酸菌口服免疫制劑,達到降低雞腸道空腸彎曲菌定殖水平的目的。本研究首先將空腸彎曲菌腸菌素受體蛋白CfrA編碼基因?qū)胧称芳壢樗崛榍蚓磉_系統(tǒng),將構建的重組乳酸乳球菌口服免疫雞,達到降低空腸彎曲菌在雞腸道中定殖的目的。利用PCR分別擴增空腸彎曲菌CfrA全基因及其N端片段,插入食品級表達載體p NZ8149多克隆位點并轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌NZ3900,通過Western blot鑒定重組菌株CfrA蛋白表達情況,篩選nisin濃度、溫度、時間等誘導條件優(yōu)化重組蛋白表達水平;將重組乳酸乳球菌經(jīng)口服免疫SPF雞,免疫后分別測定乳酸乳球菌自雞體內(nèi)的排出情況、誘導CfrA血清抗體和粘膜抗體水平,最后將空腸彎曲菌口服攻毒免疫后的雞,測定雞泄殖腔棉拭子中空腸彎曲菌的數(shù)目來判定口服免疫效果。Western blot檢測顯示CfrA全基因及其N端片段均可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達,不能分泌至胞外,篩選的最佳誘導表達條件為nisin濃度25 ng/m L、溫度37℃、時間1 h。口服乳酸乳球菌10 d內(nèi)自雞體完全排空;雞口服免疫后可產(chǎn)生CfrA蛋白特異性的血清IgG和腸粘膜sIgA抗體;重組乳酸乳球菌口服免疫后空腸彎曲菌在雞體內(nèi)的增殖速度顯著低于對照組。本研究成功構建了重組CfrA蛋白的食品級乳酸乳球菌誘導表達系統(tǒng);表達CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫雞對空腸彎曲菌在雞腸道的定殖具有一定的抑制作用。在空腸彎曲菌CfrA蛋白重組表達的基礎上,構建CjaA及CjaA-LTB蛋白重組乳酸乳球菌分泌性表達系統(tǒng)。利用PCR擴增乳酸乳球菌-MG1363-未知分泌蛋白Usp45基因分泌信號肽的編碼序列SPusp45,克隆到食品級載體p NZ8149中,以空腸彎曲菌主要免疫保護性抗原CjaA蛋白的基因片段為靶基因,并插入大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位基因(LTB),構建了表達空腸彎曲菌cjaA基因和融合表達cjaA-LTB的重組分泌性乳酸乳球菌表達系統(tǒng),并對免疫效果進行比較分析,Western blot檢測顯示cjaA基因可在重組乳酸乳球菌胞內(nèi)可溶性表達,口服乳酸乳球菌7 d內(nèi)自雞體慢慢排空;雞口服免疫后可產(chǎn)生CjaA蛋白特異性的血清IgG和腸粘膜sIgA抗體;重組乳酸乳球菌口服免疫后空腸彎曲菌在雞體內(nèi)的增殖速度顯著低于對照組。結(jié)果成功構建了重組CjaA蛋白的食品級分泌性乳酸乳球菌誘導表達系統(tǒng);表達CjaA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫雞對空腸彎曲菌在雞腸道的定殖具有一定的抑制作用。本研究成功構建了表達空腸彎曲菌保護性抗原的食品級乳酸乳球菌表達系統(tǒng),口服免疫雞可顯著降低空腸彎曲菌的定殖能力,為研制重組乳酸菌口服家禽免疫制劑防治空腸彎曲菌奠定了堅實的基礎。
【關鍵詞】：空腸彎曲菌 乳酸乳球菌 腸菌素受體CfrA 膜轉(zhuǎn)運蛋白CjaA 表達 口服免疫
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1. 引言15-28
• 1.1 空腸彎曲菌研究現(xiàn)狀15-21
• 1.1.1 病原學15-16
• 1.1.2 流行病學16-18
• 1.1.3 毒力因子18-19
• 1.1.4 檢測空腸彎曲菌的方法19-21
• 1.2 乳酸菌及其表達系統(tǒng)的研究現(xiàn)狀21-25
• 1.2.1 乳酸菌的概述21-22
• 1.2.2 乳酸菌表達系統(tǒng)22-23
• 1.2.3 食品級表達系統(tǒng)23-25
• 1.2.4 乳酸菌作為活疫苗抗原傳遞載體25
• 1.3 黏膜免疫的研究進展25-27
• 1.3.1 黏膜免疫疫苗的研究25-26
• 1.3.2 大腸桿菌不耐熱毒素(LT)作為黏膜免疫佐劑的研究26-27
• 1.4 本研究的目的與意義27-28
• 2. 材料與方法28-53
• 2.1 材料28-31
• 2.1.1 菌種28
• 2.1.2 主要試劑與試劑盒28
• 2.1.3 主要儀器28
• 2.1.4 主要溶液及培養(yǎng)基的制備28-31
• 2.2 胞內(nèi)表達空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌的構建31-39
• 2.2.1 空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌表達載體的構建技術路線圖(見圖 2-1)31-32
• 2.2.2 乳酸乳球菌表達質(zhì)粒pNZ8149質(zhì)粒圖譜32
• 2.2.3 cfrA基因的PCR擴增32-34
• 2.2.4 cfrA基因的克隆與鑒定34-37
• 2.2.5 表達cfrA基因重組乳酸乳球菌的構建37-39
• 2.3 cfrA基因在重組乳酸乳球菌中的表達及表達條件的優(yōu)化39-41
• 2.3.1 重組乳酸乳球菌cfrA基因的誘導表達39
• 2.3.2 表達產(chǎn)物的Western blot檢測分析39-40
• 2.3.3 重組乳酸乳球菌表達條件的優(yōu)化40-41
• 2.4 表達CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫研究41-42
• 2.4.1 口服免疫41
• 2.4.2 乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定41
• 2.4.3 血清IgG和腸粘膜sIgA的測定41-42
• 2.4.4 攻毒保護試驗42
• 2.5 表達空腸彎曲菌cjaA基因大腸桿菌重組表達載體的構建42-45
• 2.5.1 cjaA基因的PCR擴增42-43
• 2.5.2 cjaA基因的克隆與鑒定43-44
• 2.5.3 表達cjaA基因重組大腸桿菌的構建44-45
• 2.6 cjaA基因在重組大腸桿菌中的表達與純化45-46
• 2.6.1 重組蛋白的誘導表達45
• 2.6.2 重組蛋白的純化45-46
• 2.7 分泌表達空腸彎曲菌cjaA與cjaA-ltb基因的重組乳酸乳球菌的構建46-50
• 2.7.1 表達cjaA與cjaA-ltb基因重組分泌性乳酸乳球菌的構建示意圖46-47
• 2.7.2 cjaA、SPusp45和ltb基因的PCR擴增47-48
• 2.7.3 cjaA、SPusp45和ltb基因的克隆與鑒定48
• 2.7.4 分泌性重組表達載體的構建48-49
• 2.7.5 表達cjaA基因重組分泌性乳酸菌表達系統(tǒng)的構建49-50
• 2.7.6 融合表達cjaA與ltb重組分泌性乳酸菌表達系統(tǒng)的構建50
• 2.8 cjaA與cjaA-ltb基因在重組分泌性乳酸乳球菌中的表達50-51
• 2.8.1 重組乳酸乳球菌的誘導表達50
• 2.8.2 表達產(chǎn)物的Western blot檢測分析50-51
• 2.9 表達CjaA蛋白和融合表達CjaA與LTB重組分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究51-53
• 2.9.1 口服免疫51
• 2.9.2 乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定51-52
• 2.9.3 血清IgG和腸粘膜sIgA的測定52
• 2.9.4 攻毒保護試驗52-53
• 3. 結(jié)果與分析53-68
• 3.1 胞內(nèi)表達空腸彎曲菌cfrA基因重組乳酸乳球菌的構建53-55
• 3.1.1 cfrA基因的PCR擴增53
• 3.1.2 cfrA基因的克隆與鑒定53-54
• 3.1.3 表達cfrA基因重組乳酸乳球菌的構建54-55
• 3.2 cfrA基因在重組乳酸乳球菌中的表達及表達條件的優(yōu)化55-58
• 3.2.1 表達產(chǎn)物的Western blot檢測分析55-56
• 3.2.2 重組乳酸乳球菌表達條件的優(yōu)化56-58
• 3.3 表達CfrA蛋白的重組乳酸乳球菌口服免疫研究58-60
• 3.3.1 重組乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定結(jié)果58
• 3.3.2 血清IgG和腸粘膜sIgA抗體水平的測定結(jié)果58-59
• 3.3.3 空腸彎曲菌在雞腸道內(nèi)定殖的測定結(jié)果59-60
• 3.4 表達空腸彎曲菌cjaA基因大腸桿菌重組表達載體的構建60-61
• 3.4.1 cjaA基因的PCR擴增60
• 3.4.2 cjaA基因的克隆與鑒定60
• 3.4.3 大腸桿菌重組表達載體的構建60-61
• 3.5 cjaA基因在重組大腸桿菌中的表達與純化61-62
• 3.6 分泌表達空腸彎曲菌cjaA與cjaA-ltb基因重組乳酸乳球菌的構建62-63
• 3.6.1 SPusp45、cjaA和ltb基因的PCR擴增62
• 3.6.2 SPusp45、cjaA和ltb基因的克隆與鑒定62-63
• 3.6.3 分泌性重組表達載體的構建63
• 3.7 cjaA與cjaA-ltb基因在重組分泌性乳酸乳球菌中的表達63-66
• 3.7.1 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測分析63-64
• 3.7.2 表達產(chǎn)物的Western blot檢測分析64-65
• 3.7.3 分泌表達的Western blot檢測分析65-66
• 3.8 表達CjaA蛋白的重組分泌性乳酸乳球菌口服免疫研究66-68
• 3.8.1 重組乳酸乳球菌自雞體內(nèi)排出的測定結(jié)果66
• 3.8.2 口服免疫后雞體重的變化66-67
• 3.8.3 血清IgG和腸粘膜sIgA抗體水平的測定結(jié)果67-68
• 3.8.4 空腸彎曲菌在雞腸道內(nèi)定殖的測定結(jié)果68
• 4. 討論68-72
• 5. 結(jié)論72-73
• 參考文獻73-78
• 致謝78-79
• 個人簡介79-80
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

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  本文關鍵詞：表達空腸彎曲菌保護性抗原cfrA、cjaA基因的重組乳酸菌的構建及口服免疫研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：304252