發(fā)布時間：2021-02-16 01:54

　　豬肉是人類攝取動物蛋白的重要來源,優(yōu)質(zhì)豬肉細嫩多汁、口感豐富、肉色鮮紅,而肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat, IMF）含量與其有著極高的關聯(lián),因此成為評定肉質(zhì)的重要指標。人類對豬的長期遺傳選育投入了很大的人力和物力,更偏重于降低背膘厚度和提高瘦肉率,然而造成了肌內(nèi)脂肪含量的大幅下降,甚至高瘦肉型豬IMF含量降到了1.5%（建議范圍：2.5%-3%）,導致豬肉品質(zhì)下降、口感變差,因此今后的選育方向轉(zhuǎn)變成在確保瘦肉率的同時增加IMF含量。研究表明,肌內(nèi)脂肪含量的提高即意味著甘油三酯（triglycerol, TAG）含量的提高。DGAT1限速酶催化甘油三酯合成反應的最后一步,在哺乳動物的脂類代謝中發(fā)揮著重要作用。因此,本研究以二�；视王；D(zhuǎn)移酶1作為候選基因,構(gòu)建了肌肉特異性真核表達載體sMCK-sDGAT1,通過顯微注射和體細胞克隆分別獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)基因豬,以研究肌肉超表達DGAT1的效果和影響,為今后的研究提供材料并奠定基礎。取得的主要研究成果有：1、根據(jù)基因重組的原理,從豬MCK基因的細菌人工染色體中,獲得了MCK基因長度為7261個堿基的啟動子序列。以真核表達載... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1 前言
    2 影響脂肪代謝的基因
        2.1 影響脂肪代謝的基因
            2.1.1 乙酰輔酶A羧化酶
            2.1.2 脂肪酸合成酶
            2.1.3 脂肪酸結(jié)合蛋白
            2.1.4 脂蛋白脂酶
            2.1.5 激素敏感脂肪酶
            2.1.6 過氧化物酶體增殖蛋白激活受體γ
        2.2. DGAT1基因研究現(xiàn)狀
            2.2.1 DGAT1基因的結(jié)構(gòu)特征與生物學特征
            2.2.2 DGAT1基因的生物學功能
    3 肌肉肌酸激酶
    4 轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進展
        4.1 原核顯微注射
        4.2 精子載體介導法
        4.3 病毒介導載體法
        4.4 胚胎干細胞介導法
        4.5 體細胞克隆技術(shù)
            4.5.1 體細胞克隆技術(shù)
            4.5.2 體細胞克隆豬的應用
第二章 研究的目的和意義
第三章 材料與方法
    1 材料
        1.1 主要儀器與設備
        1.2 主要試劑及試劑盒
        1.3 常用化學試劑及其配制
            1.3.1 培養(yǎng)基的配制
            1.3.2 其他主要化學試劑的配制
        1.4 載體
        1.5 主要分子生物學軟件及數(shù)據(jù)庫
    2 試驗方法
        2.1 sMCK-sDGAT1載體的構(gòu)建
            2.1.1 pEGFP-N1L-MCK載體的雙酶切
            2.1.2 pMD18-DGAT1載體的雙酶切
            2.1.3 連接載體和基因DGAT1片段
            2.1.4 sMCK-sDGAT1載體的鑒定和線性化
            2.1.5 sMCK-sDGAT1載體的線性化和回收
        2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠制備與表達檢測
            2.2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
            2.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠F1代的制備
            2.2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠F1代DNA水平的檢測
            2.2.4 轉(zhuǎn)基因小鼠F1代RNA水平的檢測
            2.2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌相關基因蛋白水平的檢測
            2.2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌甘油三酯、脂肪酸的測定和脂肪染色
        2.3 豬胚胎成纖維轉(zhuǎn)基因細胞系的建立與檢測
            2.3.1 豬胚胎成纖維細胞系的建立
            2.3.2 轉(zhuǎn)基因細胞系的建立與檢測
        2.4 轉(zhuǎn)基因豬的制備和初步分子檢測
            2.4.1 轉(zhuǎn)基因豬的制備
            2.4.2 轉(zhuǎn)基因豬的初步分子檢測
第四章 結(jié)果與分析
    1 sMCK-sDGAT1載體的構(gòu)建
        1.1 pMD18-DGAT1載體的雙酶切
        1.2 sMCK-sDGAT1載體的鑒定和線性化
    2 轉(zhuǎn)基因小鼠的驗證
        2.1 轉(zhuǎn)基因小鼠gDNA的PCR檢測
        2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的Southern Blot檢測
        2.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的組織表達譜
        2.4 檢測DGAT1上調(diào)對骨骼肌相關基因表達的影響分析
        2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠的Western blot檢測
        2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠8-18周齡體重變化
        2.7 轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌甘油三酯和脂肪酸的測定
        2.8 轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌的脂肪染色
    3 豬胚胎成纖維細胞系的建立
        3.1 建立豬胚胎成纖維細胞系
        3.2 豬30d日齡胚胎性別的鑒定
        3.3 大白豬胎兒成纖維細胞對G418敏感性的檢測
        3.4 轉(zhuǎn)sMCK-sDGAT1載體的細胞單克隆的篩選
        3.5 轉(zhuǎn)sMCK-sDGAT1載體的細胞單克隆的分子鑒定
    4 轉(zhuǎn)sMCK-sDGAT1載體克隆豬的初步鑒定
        4.1 轉(zhuǎn)sMCK-sDGAT1載體克隆豬的DNA鑒定
        4.2 絕對定量PCR對外源基因拷貝數(shù)的檢測
第五章 討論
    1 對轉(zhuǎn)基因動物的鑒定
    2 脂肪代謝相關基因的表達情況
        2.1 ACC1
        2.2 FABP4
        2.3 UCP1
    3 骨骼肌肌內(nèi)脂肪的沉積
    4 制備轉(zhuǎn)基因克隆豬
    5 對轉(zhuǎn)基因克隆豬外源基因拷貝數(shù)的檢測
第六章 結(jié)論
    1 主要研究成果
    2 主要創(chuàng)新點
    3 本研究的不足之處
    4 下一步工作計劃
參考文獻
附錄1 載體sMCK-sDGAT1序列
附錄2 轉(zhuǎn)基因小鼠RT-PCR引物
在讀期間發(fā)表的文章
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3035930