本文關(guān)鍵詞：流行性乙型腦炎R(shí)T-RPA-LFD檢測方法的建立與評價(jià)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：流行性乙型腦炎(Japanese encephalitis,JE)是我國法定乙類傳染病,屬于人畜共患傳染病,主要引起病毒性腦炎和繁殖障礙,對人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅,也給畜牧業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的檢測方法大都存在特異性和敏感性差、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn),不能滿足獸醫(yī)臨床現(xiàn)地檢測的需要。為了更好地診斷和監(jiān)測該病,迫切需要建立一種快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測方法。近年來,核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)展迅速,它擺脫了傳統(tǒng)的溫度循環(huán)儀,可以在短時(shí)間內(nèi)迅速進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Recombinase Ploymerase Amplication,RPA)是一種新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),模擬生物體內(nèi)DNA復(fù)制過程,在37℃—42℃即可對目標(biāo)片段進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增,并在20 min完成擴(kuò)增反應(yīng),具有反應(yīng)迅速、操作簡便等技術(shù)優(yōu)點(diǎn),同時(shí)還具有高度特異和敏感的特點(diǎn)。本研究通過將重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與封閉式側(cè)向流層析技術(shù)(LFD)結(jié)合,使JEV病原檢測更加易于判定,在基層臨床快速檢測中具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究主要是建立了一種RT RPA LFD的快速檢測方法,并對其敏感性、特異性以及臨床應(yīng)用的可行性進(jìn)行評價(jià),其研究內(nèi)容與結(jié)果如下:1.建立了乙型腦炎R(shí)T-RPA-LFD檢測方法:本研究通過12株不同JEV基因的對比,選擇E基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)RPA上、下游引物數(shù)對,結(jié)合2%瓊脂糖凝膠體系篩選出最優(yōu)引物,并擴(kuò)增出293 bp的目的片段,形成RT-RPA瓊脂糖凝膠檢測體系。在最優(yōu)引物之間,設(shè)計(jì)RPA nfo長探針(46 bp),并對上游引物和探針進(jìn)行標(biāo)記,在RPA nfo反應(yīng)體系中加入探針,結(jié)合封閉式側(cè)向流層析技術(shù),建立RT RPA LFD檢測體系。以純水、細(xì)胞、豬腦組織液、蚊子組織液作為陰性對照,進(jìn)行RT RPA LFD反應(yīng)試紙條均呈現(xiàn)陰性,驗(yàn)證了RT RPA LFD方法的成立。以經(jīng)典株JEV/sw/GD/2009株、P3株、SA14 14 2株分別進(jìn)行RT RPA LFD反應(yīng)均呈現(xiàn)陽性,證明RT RPA LFD可適用于多種毒株的檢測。試驗(yàn)證明,RT RPA LFD檢測方法可以用于多種JEV分離株的檢測,方便攜帶,適用性強(qiáng),20 25 min即可獲得穩(wěn)定、準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。2.對已建立的JEV RT RPA LFD檢測方法的特異性、敏感性以及臨床應(yīng)用的可行性進(jìn)行評價(jià):本研究以豬臨床常見的7種致病病原作為特異性對照,進(jìn)行JEV RT RPA LFD反應(yīng)試紙條均呈現(xiàn)陰性,證明RT RPA LFD檢測方法的特異性強(qiáng)。用JEV RT RPA LFD檢測方法與常規(guī)RT PCR反應(yīng)進(jìn)行對比,可以檢測到的c DNA最低檢測限達(dá)100 fg、標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的最低檢測限達(dá)103拷貝/μL、JEV/sw/GD/2009株TCID50/m L最低檢測限達(dá)104.5,二種檢測方法均保持一致,說明RT RPA LFD檢測方法具有較高的敏感性。以豬腦組織液、蚊子組織液作為稀釋液模擬臨床試驗(yàn),在豬腦模擬臨床試驗(yàn)中,可檢測到的JEV TCID50/m L最低檢測限達(dá)103.5,在蚊子模擬臨床試驗(yàn)中,可檢測到的JEV TCID50/m L最低檢測限達(dá)104.5,本試驗(yàn)證明了RT RPA LFD檢測方法在臨床應(yīng)用上的可行性�？偨Y(jié):本論文建立了JEV RT RPA LFD的快速檢測方法,具有耗時(shí)短、操作簡便、結(jié)果判定準(zhǔn)確直觀的優(yōu)點(diǎn),更適合用于JEV現(xiàn)地檢測和在基層推廣應(yīng)用。
【關(guān)鍵詞】：RPA 封閉式側(cè)向流層析技術(shù) JEV 臨床檢測
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-11
• 1 引言11-21
• 1.1 JEV病原學(xué)特征11-13
• 1.1.1 JEV分子生物學(xué)特征11-13
• 1.1.2 JEV培養(yǎng)特性13
• 1.2 乙型腦炎流行病學(xué)特征13-14
• 1.3 乙型腦炎診斷方法研究進(jìn)展14-20
• 1.3.1 臨床癥狀14
• 1.3.2 病毒的分離鑒定14
• 1.3.3 血清學(xué)診斷14-16
• 1.3.4 分子生物學(xué)診斷16-17
• 1.3.5 重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)17-20
• 1.4 全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置20-21
• 1.5 研究目的與意義21
• 2 材料與方法21-33
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 毒株21-22
• 2.1.2 樣品來源22
• 2.1.3 細(xì)胞、菌種及克隆載體22
• 2.1.4 主要試劑22
• 2.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器22
• 2.2 方法22-33
• 2.2.1 病毒DNA/RNA抽提22-23
• 2.2.2 cDNA合成23-24
• 2.2.3 常規(guī)PCR檢測引物及反應(yīng)體系24-25
• 2.2.4 JEV E基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備25-28
• 2.2.5 RT-RPA凝膠反應(yīng)體系的建立28-29
• 2.2.6 RT-RPA LFD反應(yīng)體系的建立29-32
• 2.2.7 JEVRT-RPA-LFD檢測方法應(yīng)用于JEV不同分離株的檢測32
• 2.2.8 JEV RT-RPA LFD方法特異性分析32
• 2.2.9 JEV RT-RPA-LFD方法敏感性分析32
• 2.2.10 JEV臨床模擬試驗(yàn)32-33
• 3 結(jié)果與分析33-43
• 3.1 RT-RPA凝膠反應(yīng)體系的建立及引物篩選33-35
• 3.2 JEV RT-RPA-LFD方法的建立35
• 3.3 不同JEV毒株RT-RPA-LFD的敏感性分析35-36
• 3.4 JEV RT-RPA-LFD方法特異性分析36-37
• 3.5 JEV RT-RPA-LFD檢測方法的敏感性分析37-40
• 3.5.1 JEV RT-RPA-LFD的cDNA敏感性分析37-38
• 3.5.2 JEV RT-RPA-LFD的重組質(zhì)�？截悢�(shù)敏感性分析38-39
• 3.5.3 JEV RT-RPA-LFD的毒株濃度敏感性分析39-40
• 3.6 JEV RT-RPA-LFD臨床模擬試驗(yàn)40-43
• 3.6.1 豬腦模型JEV RT-RPA-LFD方法的臨床模擬試驗(yàn)40-41
• 3.6.2 蚊子模型JEV RT-RPA-LFD方法的臨床模擬試驗(yàn)41-43
• 4 討論43-46
• 全文總結(jié)46-47
• 致謝47-49
• 參考文獻(xiàn)49-54

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：流行性乙型腦炎R(shí)T-RPA-LFD檢測方法的建立與評價(jià)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：302615