發(fā)布時間：2021-02-09 05:12

　　甲基轉(zhuǎn)移酶樣21C（Methyltransferase like 21C,METTL21C）屬于賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶,在哺乳動物骨骼肌組織中特異性高表達(dá),并參與維持骨骼肌穩(wěn)態(tài),但其在家禽骨骼肌中的研究相對較少。本研究以液相色譜質(zhì)譜（LC-MS/MS）篩選出的METTL21C互作蛋白為依據(jù),挑選互作蛋白中與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白1（Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1,IGF2BP1）為研究對象,驗證METTL21C與IGF2BP1的蛋白質(zhì)互作關(guān)系,進(jìn)而分析METTL21C介導(dǎo)IGF2BP1的甲基化修飾作用;以雞成肌細(xì)胞為模型,研究METTL21C甲基化修飾IGF2BP1對雞成肌細(xì)胞增殖的影響,在蛋白質(zhì)修飾水平揭示METTL21C介導(dǎo)IGF2BP1的甲基化影響雞成肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,為解析METTL21C在家禽骨骼肌生長發(fā)育中的功能提供參考。本研究主要獲得實驗結(jié)果如下:1.基于LC-MS/MS質(zhì)譜檢測結(jié)果,篩選IGF2BP1為研究對象,成功構(gòu)建pCDNA3.1-HA-Igf2bp1融合超表達(dá)載... 

【文章來源】：陜西理工大學(xué)陜西省

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

HA-Igf2bp1片段的PCR擴(kuò)增Fig.2-1PCRamplificationofHA-Igf2bp1fragment

陜西理工大學(xué)碩士學(xué)位論文-18-注：M：DNA標(biāo)準(zhǔn)MarkerDL2000；1號泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。2.3.1.2Igf2bp1基因片段TA克隆鑒定將純化的HA-Igf2bp1片段連接至pMD19-T載體并進(jìn)行轉(zhuǎn)化，菌落PCR檢測隨機(jī)挑取的10個單克隆，結(jié)果顯示3號和7號兩個泳道擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果（1927bp）大小一致的條帶，為陽性克�。▓D2-2A）；經(jīng)測序驗證，存在3個點突變，但均為同義突變，結(jié)果表明克隆獲得HA-Igf2bp1基因片段（圖2-2B）。圖2-2菌落PCR及測序鑒定Fig.2-2IdentificationofcolonyPCRandsequencing注：A：菌落PCR結(jié)果；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)MarkerDL2000；1-10號泳道為菌落PCR產(chǎn)物；B：測序結(jié)果。2.3.1.3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重組載體鑒定將測序正確的HA-Igf2bp1片段連接至pCDNA3.1骨架載體，轉(zhuǎn)化后通過菌落PCR對連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)10個單克隆菌落均擴(kuò)增出目標(biāo)大小條帶（1908bp），表明均為陽性克�。▓D2-3A）。通過BamHI和EcoRI對隨機(jī)選取的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重組質(zhì)粒被BamHI和EcoRI切開并且條帶大小正確，說明HA-Igf2bp1基因片段已插入pCDNA3.1骨架載體中，即pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重組載體構(gòu)建成功（圖2-3B），載體質(zhì)粒圖譜見圖2-3C。

第2章METTL21C與IGF2BP1蛋白質(zhì)互作研究-19-圖2-3pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重組載體鑒定Fig.2-3IdentificationofpCDNA3.1-HA-Igf2bp1recombinantvector注：A：菌落PCR鑒定結(jié)果；M：DNA標(biāo)準(zhǔn)MarkerDL2000；1-10號泳道為10個單菌落PCR產(chǎn)物；B：酶切驗證結(jié)果；M：DL5000Marker；1號泳道為未酶切質(zhì)粒，2號泳道為雙酶切產(chǎn)物；C：pCDNA3.1-HA-Igf2bp1重組質(zhì)粒示意圖。2.3.2Igf2bp1超表達(dá)效率鑒定將Igf2bp1超表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至雞成肌細(xì)胞，采用qPCR和WesternBlot技術(shù)分別檢測Igf2bp1的超表達(dá)效率。qPCR結(jié)果顯示：與空載組相比，超表達(dá)組的Igf2bp1mRNA表達(dá)水平顯著升高，超表達(dá)效率為13.4倍（圖2-4A）。蛋白水平分別采用HA和IGF2BP1兩種抗體進(jìn)行檢測，WesternBlot結(jié)果顯示：用HA抗體孵育時，由于超表達(dá)載體攜帶HA標(biāo)簽，出現(xiàn)明顯條帶；而空載體中未攜帶HA標(biāo)簽，因此未出現(xiàn)條帶（圖2-4B），說明超表達(dá)外源基因能夠進(jìn)行表達(dá)。用IGF2BP1抗體孵育時，超表達(dá)組的IGF2BP1蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組（圖2-4C）。表明pCDNA3.1-HA-Igf2bp1載體能夠在雞成肌細(xì)胞中表達(dá)。圖2-4Igf2bp1超表達(dá)效率Fig.2-4Igf2bp1overexpressionefficiency


本文編號：3025104