豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus 2,PCV2）、豬細(xì)小病毒1型（Porcine parvovirus type 1,PPV1）和偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）是三種最重要的豬病原體,并常混合感染,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)出現(xiàn)的PRV變異株對(duì)偽狂犬病的臨床防控提出新的挑戰(zhàn)。因此,研制安全有效的防制這三種疫病的疫苗具有重要科學(xué)價(jià)值。Cap蛋白和VP2蛋白分別為PCV2和PPV1的主要免疫保護(hù)性抗原,是研制基因工程疫苗理想的靶蛋白。PRV作為活載體表達(dá)外源保護(hù)性抗原成為基因工程疫苗的研究熱點(diǎn)。本研究旨在構(gòu)建高水平表達(dá)PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重組偽狂犬病病毒,為防制這三種病毒性疾病提供基因工程候選疫苗株。為了構(gòu)建表達(dá)PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重組病毒,選擇非必需基因TK基因作為插入位點(diǎn)。以重組質(zhì)粒pMD18T-LR（TK）-EGFP為骨架,首先將密碼子優(yōu)化的PPV1-VP2基因替換EGFP,構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-LR（TK）-VP2_opti,同時(shí)將PRV-gG信號(hào)肽序列... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁(yè)數(shù)】：50 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

重組病毒的構(gòu)建示意圖

測(cè)序結(jié)果表明重組質(zhì)粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK重組質(zhì)粒 pMD18T-LR(TK)-VP2opti和 pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)轉(zhuǎn)染 2FA 結(jié)果顯示 PPV1-VP2 蛋白在 PK-15 細(xì)胞中獲得表達(dá)（圖 2.3）。00 DNA Marker; 1: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 2: VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 3: L-arm(Ec4: R-arm(ClaⅠ/Hind Ⅲ); 5: gGsp-VP2opti-His expression cassette (SpeⅠ/ClaⅠ); 6: L-arm(EcoRⅠ/SpeⅠ圖 2.2 含 VP2 表達(dá)盒的重組質(zhì)粒酶切分析Fig. 2.2 Restriction analysis of recombinant plasmids containing VP2 expression cassetteA: pMD18T-LR(TK)-VP2opti酶切分析；B: pMD18T-LR(TK)-VP2opti(SP)酶切分析iction analysis of pMD18T-LR(TK)-VP2optiB: Restriction analysis of pMD18T-LR(TK)-V

國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第二章 表達(dá)PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白的重組偽狂犬病病毒的2.2 表達(dá) EGFP 蛋白和 Cap 蛋白的重組病毒的構(gòu)建與鑒定將重組質(zhì)粒 pMD18T-LR(TK)-EGFP 和重組病毒 rPRV-TK-/gE-/gG-/3Cap+基因組共轉(zhuǎn)染 PK胞后，72 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察到了帶有許多綠色熒光的細(xì)胞病變。共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物反 2 次后，經(jīng) 1: 10 系列稀釋法進(jìn)行蝕斑純化，經(jīng)過(guò) 16 輪蝕斑克隆，將得的純化重組病毒命V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+（圖 2.4）。提取每輪重組病毒的基因組 DNA，用通用引物 P5F P4F/P4R（表 2.2）分別進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示在第 6、8、10、12、14 和 16 輪重組病毒基均擴(kuò)增出大小約 1800 bp 片段（圖 2.5 A），表明 EGFP 表達(dá)盒能夠穩(wěn)定存在于重組病V-TK-/EGFP+/gE-/gG-/2Cap+的基因組中。在第 16 輪重組病毒的 6 個(gè)克隆中均未擴(kuò)增出大2 bp 片段（圖 2.5 B），表明 Cap 基因被替換。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]豬乙型腦炎病毒—細(xì)小病毒—偽狂犬病毒活載體疫苗的研究[D]. 陳弟詩(shī).四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011

碩士論文
[1]表達(dá)PCV2-Cap蛋白的TK-/gE-/gG-重組偽狂犬病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究[D]. 夏德利.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2017
[2]表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）Cap蛋白重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其生物學(xué)特性鑒定[D]. 杜文娟.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 2016
[3]豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)及亞單位疫苗的初步研究[D]. 張家明.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 2010



本文編號(hào)：3019632